(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010737975.8
(22)申请日 2020.07.28
(71)申请人 天津国科医工科技发展有限公司
地址 300000 天津市东丽区开发区五经路
16号4号楼
(72)发明人 李艳 周传贵 周玉松 李艳杰
胡玮 韩文念 徐振 程文播
(74)专利代理机构 天津企兴智财知识产权代理
有限公司 12226
代理人 王雨杰
(51)Int.Cl.
G01N 33/82(2006.01)
G01N 30/02(2006.01)
(54)发明名称
测试剂盒
(57)摘要
本发明创造提供了一种干血斑中四种维生
品、内标混合液、第一提取液、第二提取液、复溶
液、流动相A、流动相B和洗针液。本发明所述的一
种干血斑中四种维生素的检测方法及检测试剂
盒，能够提供校准品、样品前处理所涉及的试剂
和质控品，免除实验室检测自配的繁琐步骤和造
成的误差，
保证检测结果的准确性。权利要求书2页 说明书8页 附图12页CN 111983244 A 2020.11.24
C N 111983244
A
1.一种干血斑中四种维生素检测试剂盒，其特征在于：包括校准品、质控品、内标混合液、第一提取
液、第二提取液、复溶液、流动相A、流动相B和洗针液；所述内标混合液为氘代维生素A、氘代25羟基维生素D2、氘代25羟基维生素D3和氘代维生素E。
2.根据权利要求1所述的一种干血斑中四种维生素检测试剂盒，其特征在于：所述校准品为含有梯度浓度维生素A、D、E的干血斑，所述校准品的制备方法为：先用甲醇稀释维生素A、D、E标品溶剂到梯度浓度，然后与全血混合均匀，滴加到干血斑晾干封装；所述校准品中维生素A的浓度范围为50-2000ng/mL，25羟基维生素D2浓度范围为5-40ng/mL，25羟基维生素D3浓度范围为5-200ng/mL，维生素E的浓度范围1-40μg/mL。 3.根据权利要求1所述的一种干血斑中四种维生素检测试剂盒，其特征在于：所述质控品包括第一质控品、第二质控品和第三质控品，且三者浓度依次升高；所述第一质控品中维生素A的含量范围为50-200ng/mL，25羟基维生素D2的含量范围为5-15ng/mL，25羟基维生素D3的含量范围为5-20ng/mL，维生素E的含量范围分别为1-4μg/mL；第二质控品中维生素A的含量范围为400-1000ng/mL，25羟基维生素D2的含量范围为20-30ng/mL，25羟基维生素D3的含量范围为35-100ng/mL，维生素E的含量范围为8-20μg/mL；第三质控品中维生素A的含量范围为1600-2000ng/mL、25羟基维生素D2的含量范围为35-40ng/mL、25羟基维生素D3的含量范围为160-200ng/mL、维生素E的含量范围为30-40μg/mL。
4.根据权利要求3所述的一种干血斑中四种维生素检测试剂盒，其特征在于：所述质控品的制备方法为：
用甲醇分别配制具有第一质控品、第二质控品和第三质控品相应浓度的校准品，然后将相应的校准品与全血混合均匀，滴加到干血斑上晾干封装，即得第一质控品、第二质控品和第三质控品。
5.根据权利要求4所述的一种干血斑中四种维生素检测试剂盒，其特征在于：所述干血斑中维生素A、D、E的检测试剂盒还包括内标混合液、第一提取液、第二提取液、复溶液、流动相A、流动相B和洗针液；所述内标为氘代维生素A、氘代25羟基维生素D2、氘代25羟基维生素D3、氘代维生素E的混合溶液；内标中氘代维生素A浓度范围为1-5μg/mL，氘代25羟基维生素D2浓度范围为100-300ng/mL，氘代25羟基维生素D3浓度范围为300-600ng/mL，氘代维生素E 浓度范围为10-30μg/mL。
6.根据权利要求5所述的一种干血斑中四种维生素检测试剂盒，其特征在于：所述第一提取液为甲醇和乙腈混合溶液；甲醇与乙腈的体积比为1：1，所述第二提取液为正己烷；所述复溶液为甲醇水；所述流动相A为含甲酸的水溶液，甲酸与水的体积比为0.1％；所述流动相B为含甲酸的甲醇溶液，甲酸与甲醇的体积比为0.1％；所述洗针液为甲醇和水按体积比1:1混合的混合溶液。
7.根据权利要求1至6任意一项所述的一种干血斑中四种维生素的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)样品制备：吸取一定量的全血滴到滤纸上，室温晾干置于塑料密封袋中，冷冻储存备用；
(2)样本处理：工作人员从干血斑上取下整个血斑，将该血斑与事先调配好的第一提取液、第二提取液、内标混合液涡旋混合密封，并于20-30℃的条件下超声水浴孵化；将孵化样品于-20℃冷冻10-20min，并于4-10℃冷冻离心5-10min，取400-550μL上清液进行氮吹，再用50-100μL复溶液复溶进样，用液相谱-串联质谱检测； (3)检测结果计算：将校准品出峰面积与对应内标出峰面积的比值作为纵坐标，校准品溶液的浓度作为横坐标，拟合线性方程得到校准品标准曲线；再将质控品样本的峰面积带入标准曲线中计算得到实际的浓度。
8.根据权利要求7所述的一种干血斑中四种维生素的检测方法，其特征在于：所述液相谱-串联质谱检测的液相谱条件为：流动相A为含甲酸的水溶液，流动相B为含甲酸的甲醇溶液；谱柱为Kinetex C18，50*3mm，2.6μm；柱温为40℃；检测时间为5min；进样量为10-20μL；梯度洗脱条件：0-0.5min，70％B，0.5-1.5min，100％B，1.5-3.5min，100％B，3.5-3.6min，70％B，3.6-5min，70％B，流速0.4-0.8mL/min；质谱条件为：正离子模式，采用ESI 源，碰撞气3-5psi，气帘气20-40psi，雾化气40-70psi，辅助加热气40-70psi，喷雾电压5000V，雾化温度300-500℃。
一种干血斑中四种维生素的检测方法及检测试剂盒
技术领域
[0001]本发明创造属于临床体外检测试剂技术领域，尤其是涉及一种干血斑中四种维生素的检测方法及检测试剂盒。
背景技术
[0002]维生素是机体维持正常代谢和机能所必需的一类小分子化合物，是人体必需的营养要素，主要调节体内各种代谢过程和生理活动。大多数维生素必须从食物中获得，仅少数可在体内合成或由肠道细菌产生。在人体内含量少，但生理作用很大，摄入量不足或过量都会引发相应的疾病。
[0003]维生素A是生长发育、细胞识别、视觉、免疫功能和繁殖所必需的必需维生素，还可以帮助心脏、肺、肾脏和其他器官正常运行。维生素D水平对调节钙、磷代谢至关重要，缺乏可能会导致儿童佝偻病、成人骨质疏松症、软骨症、肌无力，增加老人跌倒骨折风险。近期研究表明，维生素D缺乏还与心血管疾病、自身免疫性疾病、糖尿病以及肿瘤等疾病有关。维生素E有抗氧化的生物作用，不仅可以防止细胞膜上脂类过氧化，也可以终止自由基链反应，对动物生长、骨骼及视力发育、繁殖和免疫功能有着尤为重要的影响，同时在身体退行性病变，癌症以及心血管等疾病方面也有一定的预防作用。
[0004]临床检测维生素的方法有有紫外可见分光光度法、酶联免疫吸附法、高效液相谱法等，免疫法可实现自动化操作，检测快速、成本低，但单次仅能检测一种分析物，特异性差、易出现交叉反应，
紫外可见分光光度法和高效液相谱法所需样本量较大，灵敏度较低等无法满足检测需求。随着技术的发展，以谱作为分离手段、三重四极杆串联质谱作为检测手段的液相谱-串联质谱技术成为了定量检测生物样品中痕量目标分析物的强有力的手段。现有的基于液相谱串联质谱技术检测血清中维生素的定量检测方法多为实验室自建方法，由于每个实验室检测方法和试剂选择不同，会造成室间的检测结果差异大，特别是在面对临床大量的检测样本，很难保证检测结果的一致性。想要解决这些问题，就需要针对检测项目直接提供经过验证的配套试剂盒以及标准的检测流程，提高液相谱-串联质谱技术在临床检测的推广性，保证检测结果的一致性和准确性。
[0005]此外，在检测过程中，干血斑具备采血量少、制备操作简单、生物危险性低、生物稳定性好、运输保存方便等优势，可以更好地应用于临床，不仅减少了对样本量的需求，降低了患者的生理负担，而且便于异地检测，检测精准。而目前基于液相谱串联质谱进行干血斑中维生素A、D、E的检测方法及检测试剂盒鲜有报道。
发明内容
[0006]有鉴于此，本发明创造旨在提出一种干血斑中四种维生素的检测方法及检测试剂盒，以克服现有技术的缺陷，能够提供校准品、样品前处理所涉及的试剂和质控品，免除实验室检测自配的繁琐步骤和造成的误差，保证检测结果的准确性。
[0007]为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的：
[0008]一种干血斑中四种维生素的检测方法及检测试剂盒，包括校准品、质控品、内标混合液、第一提取液、第二提取液、复溶液、流动相A、流动相B和洗针液；所述内标混合液为氘代维生素A、氘代25羟基维生素D2、氘代25羟基维生素D3和氘代维生素E。
[0009]进一步的，所述校准品为含有梯度浓度维生素A、D、E的干血斑，所述校准品的制备方法为：先用甲醇稀释维生素A、D、E标品溶剂到梯度浓度，然后与全血混合均匀，滴加到干血斑晾干封装；所述校准品中维生素A的浓度范围为50-2000ng/mL，25羟基维生素D2浓度范围为5-40ng/mL，25羟基维生素D3浓度范围为5-200ng/mL，维生素E的浓度范围1-40μg/mL。[0010]进一步的，所述质控品包括第一质控品、第二质控品和第三质控品，且三者浓度依次升高；所述第一质控品中维生素A的含量范围为50-200ng/mL，25羟基维生素D2的含量范围为5-15ng/mL，25羟基维生素D3的含量范围为5-20ng/mL，维生素E的含量范围分别为1-4μg/mL；第二质控品中维生素A的含量范围为400-1000ng/mL，25羟基维生素D2的含量范围为20-30ng/mL，25羟基维生素D3的含量范围为35-100ng/mL，维生素E的含量范围为8-20μg/ mL；第三质控品中维生素A的含量范围为1600-2000ng/mL、25羟基维生素D2的含量范围为35-40ng/mL、25羟基维生素D3的含量范围为160-200ng/mL、维生素E的含量范围为30-40μg/ mL。
[0011]进一步的，所述质控品的制备方法为：用甲醇分别配制具有第一质控品、第二质控品和第三质控品相应浓度的校准品，然后将相应的校准品与全血混合均匀，滴加到干血斑上晾干封装，即得第一质控品、第二质控品和第三质控品。
[0012]进一步的，所述干血斑中维生素A、D、E的检测试剂盒还包括内标混合液、第一提取液、第二提取液、复溶液、流动相A、流动相B和洗针液；所述内标为氘代维生素A、氘代25羟基维生素D2、氘代25羟基维生素D3、氘代维生素E的混合溶液；内标中氘代维生素A浓度范围为1-5μg/mL，氘代25羟基维生素D2浓度范围为100-300ng/mL，氘代25羟基维生素D3浓度范围为300-600ng/mL，氘代维生素E浓度范围为10-30μg/mL。
[0013]进一步的，所述第一提取液为甲醇和乙腈混合溶液；甲醇与乙腈的体积比为1：1；所述第二提取液可以为正己烷；所述复溶液为甲醇水；所述流动相A为含甲酸的水溶液，甲酸与水的体积比为0.1％；所述流动相B为含甲酸的甲醇溶液，甲酸与甲醇的体积比为0.1％；所述洗针液为甲醇和水按体积比1:1混合的混合溶液
[0014]进一步的，包括以下步骤：
[0015](1)样品制备：吸取一定量的全血滴到滤纸上，室温晾干置于塑料密封袋中，冷冻储存备用；
[0016](2)样本处理：工作人员从干血斑上取下整个血斑，将该血斑与事先调配好的第一提取液、第二提取液、内标混合液涡旋混合密封，并于20-30℃的条件下超声水浴孵化；将孵化样品于-20℃冷冻10-20min，并于4-10℃冷冻离心5-10min，取400-550μL上清液进行氮吹，再用50-100μL复溶液复溶进样，用液相谱-串联质谱检测；
[0017](3)检测结果计算：将校准品出峰面积与对应内标出峰面积的比值作为纵坐标，校准品溶液的浓度作为横坐标，拟合线性方程得到校准品标准曲线；再将质控品样本的峰面积带入标准曲线中计算得到实际的浓度。
[0018]进一步的，所述液相谱-串联质谱检测的液相谱条件为：流动相A为含甲酸的水溶液，流动相B为含甲酸的甲醇溶液；谱柱为Kinetex C18，50*3mm，2.6μm；柱温为40℃；
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