(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710397584.4
(22)申请日 2017.05.31
(71)申请人 河南工业大学
地址 450001 河南省郑州市高新区莲花街
100号
申请人 郑州金百合生物工程有限公司
(72)发明人 赵永亮 王卫国 杜灵广 古亚楠
管景帅 苑旺 王丽洁 王卫
张仟伟 陶宜辰 林强 胡晓伟
(51)Int.Cl.
C12N 9/54(2006.01)
C12R 1/07(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种固态发酵法制备纳豆激
制备、接种、变温发酵、干燥、粉碎等单元操作。该
方法是集原料预处理、培养基与种子制备、接种、
发酵、干燥和粉碎等技术为一体，整个过程是在
洁净或无菌环境中进行，不会产生跑、冒、滴、漏
等不良现象，易于达到GMP要求。与传统法相比，
本发明具有如下特点：巧妙的原料预处理和多组
分培养基的组方设计，为纳豆激酶产生菌的生长
提供了良好的物质基础；表面活性剂的采用，使
纳豆激酶的产生与分泌明显提高；变温发酵方法
及工艺的应用，使纳豆激酶的产率提高10-45%；
方法科学，工艺合理先进，利于环保。本发明可广
泛用于纳豆激酶及其它相关产品的研发和生产。权利要求书2页 说明书6页CN 106995810 A 2017.08.01
C N 106995810
A
1.一种固态发酵法制备纳豆激酶的方法，其特征在于包括以下工艺步骤：⑴预处理大豆的制备；⑵发酵及种子培养基的制备；⑶纳豆芽孢杆菌种子的制备；⑷接种；⑸变温发酵；
(6)干燥；(7)粉碎；具体方法步骤包括：
⑴预处理大豆的制备
预处理大豆的制备是指在定时消毒的洁净环境中按照如下工艺步骤进行：
a.称量
根据生产所需，称取所用量的无病虫害的干大豆；
b.雾水润豆
将上述大豆原料置于容器中，然后用喷雾水雾化大豆，翻拌均匀；
c.适度破碎
将上述润湿的大豆采用一定的破碎工具对大豆进行适度破碎，使破碎度达到每个大豆碎裂为6-10片或米粒大小即可；
d.加水浸泡
将上述适度破碎的大豆置于消过毒的密闭浸泡罐中，按质量比加入3-8倍的无菌水搅拌均匀后静置12-24h；
e.捞豆备用
将上述适度破碎的浸泡好的大豆去水留（或取）豆，将大豆吸水膨胀用不完的多余水放出，导入它罐
以备重复利用；
⑵发酵及种子培养基的制备
发酵培养基组成：包括如下质量的成分（g/L）：预处理大豆800-980、葡萄糖2-40、蔗糖3-45、豆粕5-100、多胨3-65、胰蛋白胨2-58、甘氨酸2-76、丙氨酸1-49、丝氨酸5-56、赖氨酸3-58、天门冬氨酸5-50、组氨酸2-46、亮氨酸1-38、胶原蛋白肽0.05-6.0、生物素0.01-1.8、Vc 0.05-4.0、Ve 0.04-4.0、Vb5 0.05-6.0、烟酸0.03-4.0、烟酰胺0.05-4.0、牛磺酸0.05-4.0、L-半胱氨酸或其盐酸盐0.05-4.0、L-胱氨酸0.04-4.0、肝素钠0.02-3.0、精氨酸0.03-4.0、谷氨酸0.02-4.0、吐温-80 0.05-4.0、酪蛋白酸钠0.8-18.0、烷基糖苷APG 0.6-16.0、辅酶Q10 0.02-4.0、 MgSO4·7H2O 0.3-6、CaCl2 0.2-4，pH值=6.8-7.4；种子培养基组成：上述培养基组分中去掉吐温-80和烷基糖苷APG，其余组分及含量不变但要再加入10-50倍去离子水；
培养基的制备方法：包含以下工艺步骤：
.按本专利所述的配方和配方量分别称取或量取各组分并将其按对温度的敏感性分为3组：A组（耐高温——包括配方中的大豆全粉、大豆蛋白肽、氨基酸和无机盐），B组（较耐高温——包括配方中的2种糖、吐温-80 和酪蛋白酸钠）和C组（敏感组分——包括配方中的全部维生素），备用；
.将称取或量取的A组各组分在无菌条件下混合在一起，混合均匀后在121℃灭菌20-40min；
.将称取或量取的B组各组分在无菌条件下混合在一起，混合均匀后在115℃灭菌15-30min；
.将称取或量取的C组各组分在无菌条件下根据其溶解性用适量的溶剂溶解后无菌
过滤，将所得滤液收集在一起，备用；
.在无菌条件下，将C组滤液加入到灭过菌的A+B组组分中，搅拌混合均匀即得所述生产纳豆激酶的培养基，备用；
⑶纳豆芽孢杆菌种子的制备
在无菌环境下，将保藏的纯种纳豆芽孢杆菌菌种用接种环挑取1环在常规试管斜面培养基上划线接种，于36-38℃培养箱中培养24-32h后，挑取生长良好的单菌落涂布到新的试管斜面上，36-38℃培养箱中培养24-32h后得到活化的纳豆芽孢杆菌菌种，在无菌条件下，向活化后的纳豆芽孢杆菌斜面试管里加入2-5ml无菌水制备菌悬液，然后，分装到1～2个装有灭过菌的种子培养基的三角瓶中，在38℃、180r/min条件下振荡培养10-20h作为发酵种子，备用；此后，根据生产规模的大小，按10-20倍的放大系数进行发酵用种子的1、2、3级扩培；
⑷接种
将上述制备好的种子与制备好的发酵培养基在无菌条件下按质量比为1:5-15的比例均匀拌入发酵培养基中；
⑸变温发酵
将接过种的培养基置于固态发酵罐中，装料系数为0.2-0.5，然后在相对湿度为80-95%条件下于42-45℃发酵2-4h，36-38℃培养20-30h，20-28℃培养18-26h即可，整个发酵过程中均伴随有间歇搅拌；
(6)干燥
将上述发酵产物在一定条件下进行真空冷冻干燥或真空干燥或低温干燥后，即可；
(7)粉碎
将上述干燥后的原料采用万能粉碎法或超微破碎法进行粉碎即得不同级别的产品，该类产品还可用作进一步的深加工。
2.根据权利要求1所述的固态发酵法制备纳豆激酶的方法，其特征在于：所述步骤⑵发
酵及种子培养基的制备中的培养基的制备方法中的步骤.中所述的适量的溶剂是指能将所需组分溶解的最低量的溶剂。
3.根据权利要求1所述的固态发酵法制备纳豆激酶的方法，其特征在于：所述步骤(6)中的干燥方法条件为：真空冷冻干燥法是在真空度25-100Pa，温度20-40℃条件下冷冻真空干燥；或真空干燥法是在真空度0.01-0.085MPa，温度45-75℃条件下的真空干燥。
一种固态发酵法制备纳豆激酶的方法
技术领域
[0001]本发明属生物工程与技术领域，具体涉及一种固态发酵法制备纳豆激酶的方法。
背景技术
[0002]纳豆是日本人最爱吃的传统大豆发酵食品，纳豆激酶（Nattokinase，NK）是用大豆发酵制备的一种具有多种生物活性的蛋白酶，人们已对其进行了相当广泛深入的研究。现代科学研究已表明，它的结构为无空间折叠的线性氨基酸链，特征性作用底物为纤维蛋白，其溶栓作用优于蛇毒纤溶酶、尿激酶（UK）和蚓激酶，具有4倍大于纤溶酶的纤溶活性，分子量远远小于尿激酶、蚓激酶，且可由肠道吸收。据报道，纳豆激酶可以有效地溶解血栓，另外还具有降低血液粘度，抑制血小板凝固，降血脂、降胆固醇，改善血液循环状况，维持血细胞的正常形态和功能等多种生理功能。纳豆激酶不仅拥有纤溶酶原激活活性，而且还能直接消化利用有限的蛋白质纤维。纳豆激酶的体内外溶栓性质通过实验也已得到确定，在体内作用迅速，持续时间长，还能激活体内的纤维蛋白酶，使之温和、持续地提高血液的溶纤活性。其溶解血栓作用上的优点是它的持续性。目前临床上常用的血栓溶解剂（溶栓药物）大都是注射剂，无论是哪种注入体内，其作用时间(半衰期)都很短，只有4～20分钟，而纳豆激酶的作用时间可长达4～8小时。所以，纳豆激酶不仅有望成为临床血栓病的首选剂，其不同级别不同类型的制剂在预防和保健领域也将发挥重要作用。
[0003]虽然人们已对纳豆激酶的理化特性和生理药理活性进行了相当多的研究，但在如何高效制备纳豆激酶的方法学方面的研发工作开展较少。经典的生产纳豆与纳豆激酶所用的方法是仅仅以大豆为原料，经过浸泡、蒸煮、降温后接种发酵即可，但大豆内部菌体不易生长，产率自然不会太高；CN1025
86141B公开了一种以黄豆蒸煮水为主原料辅之以2种无机盐的作为培养基的液态发酵法，这种情况原料的利用率难免太低；CN103205409B公开了一种以黑豆为原料制备高活性纳豆激酶的方法；CN106085991A公开了一种固态发酵制备纳豆激酶的方法，它提供了一种以花生粕为主要原料制备纳豆激酶的方法；上述专利虽为生产纳豆激酶提供了多种原料选择并对产酶量的提升做出了一定贡献，但普遍存在原料预处理不充分，所用培养基营养组分不太均衡或不足，原料利用率偏低，发酵工艺优化不足或有待改进，微生物生长不甚旺盛，难以充分发挥纳豆菌的产酶特性，产酶效率不高等问题。
发明内容
[0004]为解决上述技术方法的不足或缺陷，本发明提供一种固态发酵法制备纳豆激酶的新方法。包括以下工艺步骤：⑴预处理大豆的制备；⑵发酵及种子培养基的制备；⑶纳豆芽孢杆菌种子的制备；⑷接种；⑸变温发酵；(6)干燥；(7)粉碎；
具体方法步骤为：
⑴预处理大豆的制备
预处理大豆的制备是指在定时消毒的洁净环境中按照如下工艺步骤进行：
a.称量
根据生产所需，称取所用量的无病虫害的干大豆；
b.雾水润豆
将上述大豆原料置于容器中，然后用喷雾水雾化大豆，翻拌均匀；
c.适度破碎
将上述润湿的大豆采用一定的破碎工具对大豆进行适度破碎，使破碎度达到每个大豆碎裂为6-10片或米粒大小即可；
d.加水浸泡
将上述适度破碎的大豆置于消过毒的密闭浸泡罐中，按质量比加入3-8倍的无菌水搅拌均匀后静置12-24h；
e.捞豆备用
将上述适度破碎的浸泡好的大豆去水留（或取）豆，将大豆吸水膨胀用不完的多余水放出，导入它罐以备重复利用；
⑵发酵及种子培养基的制备
发酵培养基组成：包括如下质量的成分（g/L）：预处理大豆800-980、葡萄糖2-40、蔗糖3-45、豆粕5-100、多胨3-65、胰蛋白胨2-58、甘氨酸2-76、丙氨酸1-49、丝氨酸5-56、赖氨酸3-58、天门冬氨酸5-50、组氨酸2-46、亮氨酸1-38、胶原蛋白肽0.05-6.0、生物素0.01-1.8、Vc 0.05-4.0、Ve 0.04-4.0、Vb5 0.05-6.0、烟酸0.03-4.0、烟酰胺0.05-4.0、牛磺酸0.05-4.0、L-半胱氨酸或其盐酸盐0.05-4.0、L-胱氨酸0.04-4.0、肝素钠0.02-3.0、精氨酸0.03-4.0、谷氨酸0.02-4.0、吐温-80 0.05-4.0、酪蛋白酸钠0.8-18.0、烷基糖苷APG 0.6-16.0、辅酶Q10 0.02-4.0、 MgSO4·7H2O 0.3-6、CaCl2 0.2-4，pH值=6.8-7.4；种子培养基组成：上述培养基组分中去掉吐温-80和烷基糖苷APG，其余组分及含量不变但要再加入10-50倍去离子水；
培养基的制备方法：包含以下工艺步骤：
.按本专利所述的配方和配方量分别称取或量取各组分并将其按对温度的敏感性分为3组：A组（耐高温——包括配方中的大豆全粉、大豆蛋白肽、氨基酸和无机盐），B组（较耐高温——包括配方中的2种糖、吐温-80 和酪蛋白酸钠）和C组（敏感组分——包括配方中的全部维生素），备用；
.将称取或量取的A组各组分在无菌条件下混合在一起，混合均匀后在121℃灭菌20-40min；
.将称取或量取的B组各组分在无菌条件下混合在一起，混合均匀后在115℃灭菌15-30min；
.将称取或量取的C组各组分在无菌条件下根据其溶解性用适量的溶剂溶解后无菌过滤，将所得滤液收集在一起，备用；
.在无菌条件下，将C组滤液加入到灭过菌的A+B组组分中，搅拌混合均匀即得所述生产纳豆激酶的培养基，备用；
⑶纳豆芽孢杆菌种子的制备
在无菌环境下，将保藏的纯种纳豆芽孢杆菌菌种用接种环挑取1环在常规试管斜面培养基上划线接种，于36-38℃培养箱中培养24-32h后，挑取生长良好的单菌落涂布到新的试
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