(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201610097989.1
(22)申请日 2016.02.23
C12P 19/62(2006.01)
(71)申请人华北制药集团新药研究开发有限责
任公司
地址050015 河北省石家庄市长安区和平东
路388号
(72)发明人段宝玲 张雪霞 王耀耀 任风芝
李宁 耿文飞 高任龙 郑智慧
路新华
(54)发明名称
(57)摘要
本发明属于发酵工程领域，具体涉及一种提
高微生物发酵生产两性霉素B 产量的方法。该方
法通过优化有机复合氮源和发酵条件，降低不同
质，促进两性霉素B 生物合成。发酵结束后，两性
霉素B 的发酵单位达到14469ug/ml。与优化前相
比，两性霉素B 产量提高103%，发酵时间缩短14%，
提高了设备利用率，同时易于下游的纯化。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书6页CN 105524961 A 2016.04.27
C N 105524961
A
1.一种发酵生产两性霉素B的方法，包括以下步骤：
a、制备结节性链霉素菌株的种子液
将结节性链霉素菌株的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基，26-30℃、在摇瓶或发酵罐中培养44-52 h获得种子液； 其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉20.0-30.0克、葡萄糖10.0-20.0克、热榨黄豆饼粉10.0-20.0克、酵母粉5.0-10.0克、玉米浆2.0-8.0克、氯化钠1.0-2.0克、碳酸钙3.0-4.0克，加水定容至1000mL，pH7.0-7.5，121℃灭菌30min；
b. 制备结节性链霉素菌株的发酵液
将上述种子液以体积百分比6-15 %的接种量接种于发酵培养基，在摇瓶或发酵罐中发酵，发酵24-50小时之间加入前体物质丙酸钠或正丙醇，继续发酵，总发酵时间120-140 h， 发酵温度26 -30 ℃，
得到发酵液；其中所述发酵培养基按以下方法制得：葡萄糖20.0-40.0克、玉米粉20.0-30.0克、热榨黄豆饼粉0-20.0克、棉籽蛋白粉0-30.0克、酵母粉0-10.0克、玉米浆5.0-8.0克、磷酸二氢钾0.5-0.8克、氯化钠1.0-2.0克、碳酸钙3.0-6.0克，加水定容至1000mL，pH7.0-8.0，121℃灭菌30min。
2.根据权利要求1所述的方法，所述步骤b中前体物质添加量为每升发酵液加入0. 4-4克。
3.根据权利要求1所述的方法，所述步骤b中前体物质添加时间为发酵30-40小时之间加入。
4.根据权利要求1所述的方法，步骤b中所述发酵为压力为0.05±0.01Mpa、搅拌速度为200-400rpm，通气比为1:0.8-1.2vvm。
权 利 要 求 书1/1页CN 105524961 A
一种发酵生产两性霉素B的方法
技术领域
[0001]本发明属于发酵工程领域，具体涉及一种发酵生产两性霉素B的方法。
背景技术
[0002]两性霉素B是由结节性链霉素发酵产生的，由37个碳原子构成的多烯大环内酯类抗生素，临床用于由多种深部真菌如白念珠菌、新型隐球菌、曲霉菌等引起的心脏或全身感染。对某些严重的深部真菌病如新生隐球菌脑膜炎、侵袭性曲霉病，特别是对免疫缺陷或严重粒细胞缺乏的患者的
以及某些地方性真菌病如球孢子菌病、组织胞浆菌病、皮炎芽生菌病等仍需应用两性霉素B，两性霉素B仍然是侵袭性真菌感染的一线药物及“金标准”。
[0003]两性霉素B为多烯大环内酯类抗生素，其生物合成途径为PKSI，可以分解为活化前体的生成（乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A)、内酯环的生成(多聚乙酰途径)和氨基糖的形成。在两性霉素B的生物合成途径中，内酯环的形成是限制性因素。内酯环的形成是以乙酸为起始单位、丙二酸为延续单位通过聚酮体途径缩合而成，这表明两性霉素B生物合成的重要前体物质是短链脂肪酸，这些脂肪酸前体物不易被菌体合成，因而成为限制两性霉素B生物合成的决定性因素。在两性霉素B发酵过程中加入前体物质是提高发酵单位的重要手段，通过补加前体物质，可以达到控制两性霉素B产生菌的生物合成方向及增加两性霉素B产量的目的。从外界补加前体物质，能明显地提高两性霉素B的发酵水平。但是，外源性前体物质在发酵液中的残留浓度过高，会使生产菌株中毒，不利于两性霉素B的生物合成；而前体物质不足也会大大影响两性霉素B的生产。因此，研究加入何种前体物质以及添加策略对两性霉素B的高产稳产具有重要的意义。
[0004]工业发酵过程的调控往往是一个复杂的多因素问题，直接影响到发酵效价及目的产物的生产，是工业发酵中最核心的问题之一。利用微生物发酵生产两性霉素B，其培养基成分相当复杂。影响微生物代谢的因素除培养基成分外，还包括pH值、温度等操作条件，可变因子较多。因而选择合适、高效的优化方法显得尤为重要。
[0005]有机氮源作为一种成分复杂而且组分不容易定量的培养基原料，对发酵过程影响很大。长期以来，工业发酵大都采用玉米浆等大宗农副产品作为有机氮源，不同厂家、不同批次有机氮源组分之间存在不稳定性和差异性，所以导致不同批次发酵代谢产物及代谢水平不一致，因此有机氮源的选取和使用是非常关键的。
[0006]因此，如何调整两性霉素B发酵培养基的成分以及发酵条件，加入何种前提物质，加入的量以及加入时机的选择，成为如何提高微生物发酵生产两性霉素B产量的所迫切需要研究的课题。
发明内容
[0007]本发明的目的是解决现有技术中微生物发酵制备两性霉素B存在的发酵过程不稳定及发酵水平低的问题，提供一种通过优化发酵培养基配方、发酵条件，在发酵过程中添加
前体物质，促进两性霉素B的生物合成，来提高两性霉素B产量的方法。
[0008]本发明的关键构思为：采用结节性链霉素菌株为出发菌株，在微生物发酵生产两性霉素B的过程中，优化初始pH值、发酵温度及时间、接种量等条件，优化新型复合有机氮源，在两性霉素B产物合成初期，添加前体物质，提高两性霉素B的产量。
[0009]本发明所提供的一种发酵生产两性霉素B的方法，包括以下步骤：
a、制备结节性链霉素菌株的种子液
将结节性链霉素菌株的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基，26-30℃、在摇瓶或发酵罐中培养44-52 h获得种子液。
[0010]其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉20.0-30.0克、葡萄糖10.0-20.0克、热榨黄豆饼粉10.0-20.0克、酵母粉5.0-10.0克、玉米浆2.0-8.0克、氯化钠1.0-2.0克、碳酸钙3.0-4.0克，加水定容至1000mL，pH7.0-7.5，121℃灭菌30min。
[0011]本发明所述两性霉素B产生菌可选用菌种编号ATCC14899的菌种。
[0012] b. 制备结节性链霉素菌株的发酵液
将上述种子液以体积百分比6-15 %的接种量接种于发酵培养基，在摇瓶或发酵罐中发酵，发酵24-50小时之间加入前体物质丙酸钠或正丙醇，继续发酵，总发酵时间120-140 h，发酵温度26 -30 ℃，得到发酵液。
[0013]其中所述发酵培养基按以下方法制得：葡萄糖20.0-40.0克、玉米粉20.0-30.0克、热榨黄豆饼粉0-20.0克、棉籽蛋白粉0-30.0克、酵母粉0-10.0克、玉米浆5.0-8.0克、磷酸二氢钾0.5-0.8克、氯化钠1.0-2.0克、碳酸钙3.0-6.0克，加水定容至1000mL，pH7.0-8.0，121℃灭菌30min。
[0014]其中所述步骤b中前体物质添加量为每升发酵液加入0. 4-4克。
[0015]其中所述前体物质添加时间为发酵30-40小时之间加入。
[0016]其中所述步骤b中棉籽蛋白粉和酵母粉的质量比为6：1-3：1。
[0017]其中步骤b中所述发酵为压力为0.05±0.01Mpa、搅拌速度为200-400rpm，通气比为1:0.8-1.2vvm。
[0018]其中所述种子液以体积百分比8-10%的接种量接种于发酵培养基。
[0019]其中所述种子液在种子培养基中培养46-48小时。
[0020]其中所述发酵培养基的初始最适pH值为为7.3-7.6。
[0021]其所述步骤b中中棉籽蛋白粉和酵母粉，比例为5:1-4:1。
[0022]上述优选条件，所获得两性霉素B的产量从7131 ug/ml提高到14469ug/ml，为两性霉素B的工业化生产提供了一种新的方法。本发明中通过优化发酵配方、新型复合有机氮源和发酵条件，保证了不同发酵批次间代谢产物及发酵水平的一致性；加入前体物质后可显著促进两性霉素B的生物合成。优化
后两性霉素B产量提高103%，发酵时间缩短14%，提高了产能，缩短了生产周期，降低了能耗及三废排放。
具体实施方式
[0023]下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明均为工业级原料；所用的棉籽蛋白粉由青岛科瑞提供，酵母粉由安琪酵母有限公司提供，丙酸钠、正丙醇由天津永大化学试剂有限公
司提供。
[0024]实施例1、10L自动发酵罐发酵制备两性霉素B
结节性链霉素菌株种子液的制备
将结节性链霉素菌株的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基，26℃、220 rpm、培养48 h获得种子液；
其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉20.0克、葡萄糖20.0克、热榨黄豆饼粉10.0克、酵母粉10.0克、玉米浆8.0克、氯化钠1.0克、碳酸钙3.0克，加自来水定容至1000mL，pH7.0，121℃灭菌30min。
[0025]本发明所述两性霉素B产生菌为菌种编号ATCC14899的菌种。
[0026]发酵培养基组成：
葡萄糖280.0克、玉米粉140.0克、热榨黄豆饼粉140.0克、玉米浆35.0克、磷酸二氢钾3.5克、氯化钠7.0克、碳酸钙28克，加自来水定容至7000mL，pH7.0，121℃灭菌30min，10L自动发酵罐发酵培养。
[0027]发酵条件：罐内的压力为0.05MPa，通气比为1：1.0vvm，装料量为7L，种子培养46小时后接种，接种量为10%，培养温度为26℃，转速为300 r/min。在发酵培养开始24小时后加入丙酸钠，每升发酵液加入0.4 g，发酵培养140小时。
[0028]结果见表1，在优化的发酵条件下，采用传统的黄豆饼粉作为有机氮源，在发酵过程中加入前体物质，发酵结束后，两性霉素B的发酵单位为8557ug/ml。
[0029]实施例2、5L自动发酵罐发酵制备两性霉素B
结节性链霉素菌株种子液的制备
将结节性链霉素菌株的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基， 28℃、220 rpm、培养46 h获得种子液；
其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉30.0克、葡萄糖10.0克、热榨黄豆饼粉15.0克、酵母粉8.0克、玉米浆5.0克、氯化钠2.0克、碳酸钙4.0克，加自来水定容至1000mL，pH7.5，121℃灭菌30min。
[0030]本发明所述两性霉素B产生菌为菌种编号ATCC14899的菌种。
[0031]发酵培养基组成：
葡萄糖90.0克、玉米粉90.0克、棉籽蛋白粉90.0克、酵母粉15.0克、玉米浆18.0克、磷酸二氢钾2.1克、氯化钠4.5克、碳酸钙9克，加自来水定容至3000mL，pH7.5，121℃灭菌30min，5L自动发酵罐发酵培养。
[0032]发酵条件：罐内的压力为0.05MPa，通气比为1：0.8vvm，装料量为3L，种子培养46小时后接种，接种量为8%，培养温度为28℃，转速为400 r/min。在发酵培养开始50小时后加入正丙醇，每升发酵液加入4g，发酵培养120小时。
[0033]结果见表1，在优化的发酵条件下，采用棉籽蛋白粉和酵母粉（6：1）作为有机氮源，在发酵过程中加入前体物质，发酵结束后，两性霉素B的发酵单位为14469ug/ml。
[0034]实施例3、10L自动发酵罐发酵制备两性霉素B
结节性链霉素菌株种子液的制备
将结节性链霉素菌株的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基，30℃、220 rpm、培养44 h获得种子液；
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