(10)申请公布号 (43)申请公布日 2010.04.07
*CN101692038A*
(21)申请号 200910075694.4(22)申请日 2009.10.14
G01N 21/31(2006.01)G01N 1/28(2006.01)
(71)申请人华北制药凯瑞特药业有限公司
地址052165 河北省石家庄市经济技术开发
区(良村)扬子路11号(72)发明人王永维 刘浩 陈剑琴 张莉
张永祥 刘英华 韩新峰(74)专利代理机构石家庄国域专利商标事务所
有限公司 13112
代理人白海静(54)发明名称
本发明公开了一种脂质体中磷脂含量的测定方法，它包括以下步骤：制备A 显剂、B 显剂；配制标准储备液；配制样品溶液；绘制标准曲线；进行样品的含量测定：精密吸取制备的脂质体样品溶液0.5ml 于15×200mm 试管中，依次加入0.4ml 浓度为10N 硫酸和30％过氧化氢溶液0.1ml ；温度170℃恒温加热60分钟；冷却后，在每个试管中加入9ml 蒸馏水，混匀吸取1.5ml 于另一试管，再分别加4.6ml 显A 和0.1ml 显B 溶液，于100℃水浴加热15分钟；冷却后在波长在822nm 处比测定吸收度；将所得样品吸收度数值代入回归曲线方程，求出样品中磷的含量。本发明方法简便、易操作，大大提高了测定结果的准确度，也提高了测定结果精密度。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页
CN 101692038 A C N 101692038 A
1.一种脂质体中磷脂含量的测定方法，其特征在于它包括以下步骤：
a、显剂的制备
A显剂：精密称取0.22克钼酸铵，用蒸馏水溶解后倒入100毫升的容量瓶中，然后缓慢加入4.72毫升分析纯硫酸，放凉后稀释定容至刻度，并且倒入棕瓶中冷藏；
B显剂：精密称取15.00克L-抗坏血酸于烧杯中，用14％Na2SO3溶解并定容至100毫升容量瓶中，倒入棕瓶中冷藏；
b、磷标准储备液的配制：精确称取经烘箱干燥的分析纯磷酸二氢钾0.4394克溶解转移至1000毫升容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀既得100ug.mL-1浓度；
c、样品溶液配制：精确吸取1.0ml被测样品脂质体溶液于10毫升容量瓶中，加水稀释至刻度；
d、标准曲线绘制精密吸取磷标准储备液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml分别置于试管中，得到质量浓度分别为10、20、40、60、80、100ug.mL-1的样品，分别加入0.4毫升SO4和0.1毫升30％H2O2消化，将该试管在170℃恒温60分钟；冷却后在每个10N的H
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试管中加入9ml蒸馏水，混匀后逐个吸取1.5ml于另一试管，再分别加4.6ml A显剂和0.1ml B显剂溶液，于100℃水浴加热15-20分钟；冷却后在波长822-830nm处比测定吸收值，以质量浓度ug.mL-1为横坐标，吸收值A为纵坐标，绘制标准曲线；
e、样品的含量测定：
精密吸取制备的样品溶液0.5ml于15×200mm试管中，依次加入0.4ml浓度为10N硫酸和30％过氧化氢溶液0.1ml消化；温度170℃恒温加热60分钟；冷却后，在每个试管中加入9ml蒸馏水，混匀吸取1.5ml于另一试管，再分别加4.6ml显A和0.1ml显B 溶液，于100℃水浴加热15分钟；冷却后在波长在822-830nm处比测定吸收度；将所得样品吸收度数值代入回归曲线方程，求出样品中磷的含量。
2.根据权利要求1所述的脂质体中磷脂含量的测定方法，其特征在于所说的消化时将试管放置到预先升温170℃并且恒定的多孔恒温控制箱内进行。
3.根据权利要求1或2所述的脂质体中磷脂含量的测定方法，其特征在于所说的测定吸收度的波长在822nm。
一种脂质体中磷脂含量的测定方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种药物载体的质量控制方法，具体地说是脂质体中磷脂含量的测定方法。
背景技术
[0002] 脂质体是由磷脂双层构成的具有水相内核的脂质微囊。由于其具有缓释、低毒及组织靶向性等特点，目前已应用于包载药物、基因转移等许多方面。磷脂是脂质体的重要组分之一。其易发生水解和氧化，水解会导致脂质体中包封药物的渗漏，而氧化产生的氧化反应对人体有一定得毒性。因此测定磷脂含量是衡量脂质体稳定性一项重要指标。目前测定磷脂含量的方法，主要有高效液相普法、钼蓝比法、钒钼酸盐紫外分光光度法、荧光法、硫氰铁铵显法。但现有文献所公开的内容一般均是从检测原理上进行总的论述与探讨。故其所述方法专属性差，精确度低。而在实际应用中，通常对特定磷脂的检测需要有特定的检测方法。CN 1358997提供了一种针对血清高密度脂蛋白磷脂及低密度脂蛋白磷脂的测定方法；研究者白研提供了一种对广东德庆何首乌中卵磷脂含量进行测定的方法(广东药学(2004)第14卷第5期第3页)。李宝齐提供了一种测定脂质体凝胶剂中磷脂含量的方法(中国药剂学杂志(2005)第3卷第5期)，该方法是将样品用硝酸、高氯酸消化，调pH值后，加入钼蓝法显剂，在830nm测定吸收度，经计算得脂质体凝胶剂中磷脂的含量。该方法虽然是针对脂质体中磷脂特别设计的检测方法，但其显试剂溶液配比不合理，显结果差；且所用试剂种类多、操作步骤复杂。在检测过程中还需电炉加热，温度不易控制，同时易产生爆沸现象。
发明内容
[0003] 本发明的目的就是要提供一种准确性高，且安全、简便、易操作的针对脂质体中磷脂进行含量测定的新方法。
[0004] 本发明目的是这样实现的：
[0005] 本发明所提供的脂质体中磷脂含量的测定方法，包括以下步骤：
[0006] a、显剂的制备
[0007] A显剂：精密称取0.22克钼酸铵，用蒸馏水溶解后倒入100毫升的容量瓶中，然后缓慢加入4.72毫升分析纯硫酸，放凉后稀释定容至刻度，并且倒入棕瓶中冷藏；[0008] B显剂：精密称取15.00克L-抗坏血酸于烧杯中，用14％Na2SO3溶解并定容至100毫升容量瓶中，倒入棕瓶中冷藏；
[0009] b、磷标准储备液的配制：精确称取干燥的分析纯磷酸二氢钾0.4394克溶解转移至1000毫升容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀既得100ug.mL-1浓度。
[0010] c、样品溶液配制：精确吸取1.0ml被测样品脂质体溶液于10毫升容量瓶中，加水稀释至刻度；
[0011] d、标准曲线绘制精密吸取标准储备液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0m1分别置
于试管中，得到质量浓度分别为10、20、40、60、80、100ug.mL-1的标样，分别加入0.4 SO4和0.1毫升30％H2O2消化，消化时将该试管放置到预先升温170℃并毫升10N的H
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且恒定的多孔恒温控制箱消化60分钟；然后取出试管，冷却后在每个试管中加入9ml蒸馏水，混匀后逐个吸取1.5ml于另一试管，再分别加4.6ml A显剂和0.1ml B显剂溶液，于100℃水浴加热15分钟；冷却后在波长822-830nm处比测定吸收值，以质量浓度ug.mL-1为横坐标，吸收值A为纵坐标，绘制标准曲线；
[0012] e、样品的含量测定：精密吸取制备的样品溶液0.5ml于15×200mm试管中，依次加入0.4ml浓度为10N硫酸和30％过氧化氢溶液0.1ml消化；消化时将该试管放置到预先升温恒定的多孔恒温控制箱中，设定温度170℃，加热时间60分钟；然后取出试管。冷却后在每个试管中加入9ml蒸馏水，混旋后逐个吸取1.5ml于另一试管，再分别加4.6ml A显剂和0.1ml B显剂溶液，于100℃水浴加热15分钟；冷却后在波长在822-830nm 处比测定样品的吸收度。将所得样品吸收度数值代入回归曲线方程，求出样品中磷的含量。
[0013] 本发明方法检测所依据的原理是：在一定温度下的酸性溶液中，磷酸根可与钼)2-络合，在还原剂作用下生成蓝络合物(2MoO2·4MoO3)2·H3PO4，蓝强度酸根(MoO
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与溶液中的磷酸根呈正比，用分光光度法在最大吸收波长处测定其吸收值，根据标准曲线计算磷含量。
[0014] 本发明的创新之处在于，采用的显剂其显反应颜稳定、显示效果好；所用试剂种类少、方法简便、易操作，大大提高了测定结果的准确度，也提高了测定结果的精密度；在消化时将试管放置到预先升温170℃并且恒定的多孔恒温控制箱内进行，由此可有效控制溶液的反应温度，克服了现有方法中易发生的爆沸、蒸干等现象，同时提高了实验操作的安全性，减少环境污染。
[0015] 本发明将测定波长选择在822nm，进一步提高了该方法检测的精确度。
附图说明
[0016] 图1是文献方法实验结果图
[0017] 图2是本发明方法试验结果图
[0018] 本发明的有益效果通过以下实验得到了证明：
[0019] 精密度试验
[0020] 试验方法：
[0021] 精密吸取三个不同体积的磷标准储备液分别置于试管中，得到到一定的质量浓度的标样，依次加入0.4ml浓度为10N硫酸和30％过氧化氢溶液0.1ml；将该试管放置到预先升温170℃并且恒定的多孔恒温控制箱消化60分钟；然后取出试管，冷却后在每个试管中加入9ml蒸馏水，混旋后逐个吸取1.5ml于另一试管，再分别加4.6ml A显剂和0.1ml B显剂溶液，于100℃水浴加热15分钟；冷却后在波长822nm处比测定吸收值，同时制备5个平行样品，一个空白对照品，于822nm处同法测定，计算该精密度试验方法的RSD值为1.08。
[0022] 具体实验数据见表1
[0023] 表1精密度实验结果
[0024]
[0025] 回收率试验：
[0026] 取三组试验，分别配制低、中、高三种浓度磷标准储备液，操作条件与精密度试验方法相同，于822nm处测定吸收度；如法重复3次取平均值。
[0027] 具体实验数据见表2
[0028] 表2回收率实验结果
[0029]
加入量测定量回收率％加入量测定量回收率％加入量测定量回收率％
15.014.6697.735.035.12100.355.056.76103.2
15.015.31102.135.034.0997.455.053.8397.9
15.014.2795.135.034.6699.055.055.10100.2
[0030] 三组试验回收率为95.1～103.2％
[0031] 稳定性试验
[0032] 试验操作条件与精密度试验方法相同，经过在100分钟内多次测定吸收值，结果基本无变化，说明该方法在加入显剂反应生成的络合物稳定性良好。具体实验数据见表3
[0033] 表3稳定性实验结果
[0034]
[0035] 对比试验(本发明方法与现有技术对比试验)：
[0036] 现有技术(按照《广东药学》广东德庆何首乌中卵磷值含量测定)重复性测定吸光度值(以标准磷30ppm含量为例)。
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