(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011307749.2
(22)申请日 2020.11.20
(71)申请人 江南大学
地址 214000 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大
道1800号
(72)发明人 周哲敏 郭军玲 来乾朋 程中一
刘中美 崔文璟 周丽 韩来闯
(74)专利代理机构 哈尔滨市阳光惠远知识产权
代理有限公司 23211
代理人 林娟
(51)Int.Cl.
C12N 9/88(2006.01)
C12N 15/60(2006.01)
C12N 15/70(2006.01)
C12N 1/21(2006.01)
C12P 13/02(2006.01)C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种融合型腈水合酶及其应
用，属于基因工程领域和酶工程领域。本发明公
开了多种稳定性提高的亚基融合型腈水合酶，属
于基因工程领域。本发明将来源于Pseudomonas
putida NRRL 1886的腈水合酶作为初始对象，
分别通过不同种类不同长度Linker融合其β亚基
和α亚基，得到多种亚基融合型腈水合酶，稳定
性得到显著提高。本发明方法简单高效，不仅得
到了稳定性显著提高的腈水合酶可用于工业生
产，还总结了基因融合影响腈水合酶稳定性的规
律，
为提高腈水合酶稳定性提高理论研究。权利要求书1页 说明书11页序列表8页 附图3页CN 112322607 A 2021.02.05
C N 112322607
A
1.一种融合型腈水合酶，其特征在于，所述融合型腈水合酶同时表达了α亚基、β亚基及调控亚基，所述融合型腈水合酶的β亚基和α亚基之间通过Linker融合；所述Linker的通式为：A(EAAAK)n A，或(GGSG)n ，或(PA)n ，其中，n是至少为1的整数。
2.如权利要求1所述的融合型腈水合酶，其特征在于，所述Linker的核苷酸序列选自SEQ ID NO.5-22所示的序列。
3.如权利要求1或2所述的融合型腈水合酶，其特征在于，所述β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，调控亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.编码权利要求1-3任一所述的融合型腈水合酶的基因。
6.表达权利要求1-3任一所述的融合型腈水合酶的重组细胞。
7.如权利要求6所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是以大肠杆菌为宿主细胞。
8.一种提高腈水合酶热稳定性和/耐受性的方法，其特征在于，所述方法为：融合了腈水合酶的β亚基和α亚基；所述融合型腈水合酶的β亚基和α亚基之间通过Linker连接；所述Linker的通式为：A(EAAAK)n A，或(GGSG)n ，或(PA)n ，其中，n是至少为1的整数。
9.一种生产酰胺类物质的方法，其特征在于，将权利要求1所述的融合型腈水合酶添加至含有腈类有机物的反应体系中进行反应。 10.权利要求1-3任一所述的融合型腈水合酶，或权利要求4所述的基因，或权利要求5所述的重组载体，或权利要求6或7所述的重组细胞在催化腈类化合物水合成相应的酰胺类产物中的应用。
权 利 要 求 书1/1页CN 112322607 A
一种融合型腈水合酶及其应用
技术领域
[0001]本发明涉及一种融合型腈水合酶及其应用，属于基因工程领域和酶工程领域。
背景技术
[0002]腈水合酶(Nitrle hydratase，NHase)能催化腈类化合物合成相应的酰胺类产物，在丙烯酰胺和烟酰胺的工业生产上已经被广泛应用，在工业生产中，NHase主要应用于高纯度烟酰胺和丙烯酰胺的生产，丙烯酰胺的酶法生产是绿生物催化法代替化学合成法的典型案例，具有诸多优势如：工艺简单、反应条件温和、能耗低、三废少等，因此，Nhase在工业生产中是比较重要的酶。
[0003]但是，目前NHase在工业应用过程中普遍存在热稳定性差的问题，例如，来源于Pseudomonas chlororaphils B23、Rhodococcus rhodochrousJ1、Rhodococcus sp.N-774的NHase仅在20℃以下稳定，而腈类的水合过程属于放热反应，所以在工业催化过程中，需要用冷凝水来降低反应温度从而造成能源浪费；此外，腈水合酶的不稳定性还体现在对底物(腈类有机物)和产物(酰胺类有机物)的耐受性差，容易使腈水合酶失活；例如在丙烯酰胺的酶法制备过程中，由于腈水合酶对底物和产物的耐受性不高，导致终产物丙烯酰胺只能维持较低的水平，给后续的丙烯酰胺浓缩工艺带来影响。随着市场的不断拓展，酰胺类化合物的需求也日益剧增，因此如何提高腈水合酶的热稳定性及产物耐受性已成为研究重点。
[0004]为了解决NHase热稳定性差的问题，许多课题组采取了各种各样的策略，包括催化工艺的优化、野生菌株的筛选和驯化，以及NHase的分子改造等等；发明人课题组在前期研究过程中，通过分子手段在基因水平上以共价键的方式融合两个亚基，消除了亚基解聚的可能性，虽然使得融合型腈水合酶的稳定性提高，但是融合型腈水合酶在50℃半衰期最高仅仅是26min，仍旧不能满足工业需求。
发明内容
[0005]针对腈水合酶工业应用中对底物和产物的耐受性差、热稳定差的问题，本发明采用基因合策略，将Pseudomonas putida NRRL 1886来源的NHase的β和α两个亚基通过螺旋式，或柔性，或刚性的连接肽融合到一起，得到一种稳定性有很大提高的亚基融合型NHase，有望应用于工业生产。
[0006]本发明首先提供了一种融合型腈水合酶，所述融合型腈水合酶同时表达了α亚基、β亚基及调控亚基，所述融合型腈水合酶的β亚基和α亚基之间通过Linker融合；所述Linker 的通式为：A(EAAAK)n A，或(GGSG)n，或(PA)n，其中，n是至少为1的整数。
[0007]在本发明的一种实施方式中，所述融合型腈水合酶的β亚基和α亚基之间通过Linker融合，所述融合是将β亚基的C端和α亚基的N端连接起来。
[0008]在本发明的一种实施方式中，所述Linker的通式中的n值为：1≤n≤15。
[0009]在本发明的一种实施方式中，所述Linker的核苷酸序列为选自SEQ ID NO.5-22所
示的序列。
[0010]在本发明的一种实施方式中，所述β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，调控亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0011]在本发明的一种实施方式中，所述β亚基的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，α亚基的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示，调控亚基的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。[0012]本发明还提供了编码上述融合型腈水合酶的基因。
[0013]本发明还提供了携带上述融合型腈水合酶基因的重组载体。
[0014]在本发明的一种实施方式中，所述重组载体以pET-24a质粒作为表达载体。[0015]本发明还提供了表达上述融合型腈水合酶的重组细胞。
[0016]在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞以大肠杆菌为宿主细胞。
[0017]本发明还提供了上述融合型腈水合酶的制备方法，所述方法为：将上述重组细胞接种至LB培养基中，35～37℃培养至OD600为0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG于25℃诱导12-18h，表达融合型腈水合酶。
[0018]在本发明的一种实施方式中，所述方法是将所述重组细胞接种于含卡那霉素的LB 表达培养基中，37℃、200r/min振荡培养至OD600为0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG至0.1mM，Co2+至0.1mg/L，25℃诱导12-18h，表达融合型腈水合酶。
[0019]在本发明的一种实施方式中，所述方法还包括收集上述重组细胞的菌体，将菌体破碎后收集上清，将上清膜过滤后，用Strep Trap HP柱分离得到融合型腈水合酶。[0020]本发明还提供了一种提高腈水合酶热稳定性和/耐受性的方法，所述方法为：融合了腈水合酶的β亚基和α亚基；所述融合型腈水合酶的β亚基和α亚基之间通过Linker连接；所述Linker的通式为：A(EAAAK)n A，或(GGSG)n，或(PA)n，其中，n是至少为1的整数。[0021]在本发明的一种实施方式中，所述Linker的通式中的n值为：1≤n≤15。
[0022]在本发明的一种实施方式中，所述Linker的核苷酸序列如SEQ ID NO.5-22所示。[0023]在本发明的一种实施方式中，所述β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，调控亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0024]本发明还提供了一种生产酰胺类物质的方法，将权利要求1所述的融合型腈水合酶添加至含有腈类有机物的反应体系中进行反应。
[0025]在本发明的一种实施方式中，向终浓度为200-400mmol/L的烟腈溶液中添加至少0.4mg/mL的融合型腈水合酶，得到反应体系，将反应体系置于20-28℃反应8-15min。[0026]本发明还提供了上述融合型腈水合酶，或上述基因，或上述重组载体，或上述重组细胞在催化腈类化合物水合成相应的酰胺类产物中的应用。
[0027]有益效果
[0028](1)采用本发明的融合型腈水合酶，相对于野生酶，其热稳定性得到了显著的提高，其中，融合型腈水合酶A8的半衰期高达139min，是野生酶的7.7倍；融合型腈水合酶B8的半衰期高达94min，是野生酶的5.2倍；融合型腈水合酶C8的半衰期高达53min，是野生酶的近3倍。本发明提供的热稳定性提高的融合型腈水合酶，可以克服工业生产中腈水合酶热稳定性低的缺陷，提高产率，节约成本。
[0029](2)采用本发明提供的技术方案，底物耐受性及产物耐受性均得到了显著的提高，其中，采用底物3-氰基吡啶进行反应时，融合型腈水合酶A8、B8、C8的相对酶活由采用野生
酶进行反应时的较低的相对酶活(30％)提高到84％、89％、86％；采用产物尼克酰胺下处理30min后，融合型腈水合酶A8、B8、C8的相对酶活由采用野生酶进行反应时的较低的相对酶活(77％)提高到80％、94％、86％。
附图说明
[0030]图1：融合型腈水合酶野生酶及A1、A2、A3、A4、A6、A8的SDS-PAGE图。
[0031]图2：融合型腈水合酶野生酶及B1、B2、B3、B4、B6、B8的SDS-PAGE图。
[0032]图3：融合型腈水合酶野生酶及C1、C2、C3、C4、C6、C8的SDS-PAGE图。
[0033]图4：野生型腈水合酶和融合型腈水合酶的比酶活。
[0034]图5：野生型腈水合酶和融合型腈水合酶的底物耐受性。
[0035]图6：野生型腈水合酶和融合型腈水合酶的产物耐受性。
具体实施方式
[0036]下述实施例中的酶A1-酶A16分别定义为：通过螺旋式Linker连接β亚基和α亚基的融合型腈水合酶，Linker的通式为A(EAAAK)n A；其中，A为丙氨酸，E为谷氨酸，K为赖氨酸；n ＝1-12，且n为整数。
[0037]下述实施例中的酶B1-酶B16分别定义为：通过柔性Linker连接β亚基和α亚基的融合型腈水合酶，Linker的通式为(GGSG)n；其中，G为甘氨酸，S为丝氨酸；n＝1-16，且n为整数。
[0038]下述实施例中的酶C1-酶C16分别定义为：通过刚性Linker连接β亚基和α亚基的融合型腈水合酶，Linker的通式为(PA)n；其中，P为脯氨酸，A为丙氨酸；n＝1-16，且n为整数。[0039]下述实施例中所涉及的Linker汇总如表1所示。
[0040]表1：融合型腈水合酶β亚基和α亚基的Linker汇总
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议