(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810870915.6
(22)申请日 2018.08.02
(83)生物保藏信息
CGMCC NO:15546 2018.04.02
(71)申请人 中国农业科学院兰州兽医研究所
地址 730046 甘肃省兰州市城关区徐家坪1
号
(72)发明人 李有全 李禤 关贵全 刘军龙
刘爱红 王锦明 殷宏 罗建勋
刘志杰 独军政 高闪电 刘光远
任巧云 陈泽 杨吉飞
(74)专利代理机构 兰州振华专利代理有限责任
公司 62102
代理人 张晋
(51)Int.Cl.C12N 1/20(2006.01)A23K 10/18(2016.01)C12R 1/25(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开一株能防治牛羊腹泻病的菌株。
本发明的植物乳杆菌，
于2018年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，
保藏编号为CGMCC NO:15546。本发明的的植物乳
杆菌可在食草动物饲养中的应用，也可在制备食
动物的饲料中的应用。本发明的植物乳杆菌菌
株，具有很强的黏附及抑菌能力，有很好的耐酸、
耐胃肠道以及耐胆盐能力，能有效的防治牛羊腹
泻病。权利要求书1页 说明书6页 附图5页CN 109022313 A 2018.12.18
C N 109022313
A
1.一株植物乳杆菌，于2018年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO:15546。
2.权利要求1所述的植物乳杆菌在食草动物饲养中的应用。
3.权利要求1所述的植物乳杆菌在制备食草动物的饲料添加剂中的应用。
4.权利要求1所述的植物乳杆菌在制备食草动物的饲料中的应用。
权 利 要 求 书1/1页CN 109022313 A
一株植物乳杆菌
技术领域
[0001]本发明涉及一株能防治牛羊腹泻病的菌株。
背景技术
[0002]益生菌被定义为活的微生物，当摄入足够的数量时，能给予宿主健康作用。这些能对健康有益处的特定属的益生菌菌属有：乳杆菌属，双歧杆菌，酵母属，肠球菌属，小球菌属，明串珠菌属，芽孢杆菌属等。目前研究和应用最为广泛的益生菌是乳杆菌(Lactobacillus)以及双歧杆菌(Bifidobacterium)。其中存在于机体肠道中并在食品中广泛添加的乳杆菌种主要有：卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、格氏乳杆菌(Lactobacillus gassed)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。根据国家《食品安全法》及其实施条例的有关规定，国家卫生部卫办监督发〔2010〕65号文件规定了《可用于食品的菌种名单》，其中乳杆菌属有14种，植物乳杆菌在列。乳酸菌在发酵过程中，不仅可使机体中的乳糖、蛋白质等物质转化成乳酸、半乳糖、氨基酸及小分子肽链等易被人体消化和吸收的小分子物质，还可代谢产生机体需要的多种B族维生素等物质为机体提供营养。因此，在饲料中添加乳酸菌可很好的满足机体对各类营养物质的需求，大大提高机体对营养物质例如钙类物质的吸收利用效率，饲料中摄入的乳酸菌可作用于机体肠道内壁形成有益菌及生物屏障，并通过产生大量的短链脂肪酸(乳酸、乙酸等)、过氧化氢、细菌素或多肽等物质，从而发挥生物学屏障作用，阻止 病原微生物的侵袭，形成良好的机体肠道微生态平衡系统。另外，乳酸菌菌体抗原及代谢物通过刺激肠粘膜淋巴结，激活免疫活性细胞，从而产生特异性抗体与致敏淋巴细胞，从而控制炎症性肠病、缓解过敏反应、增强天然免疫。食用添加益生菌的饲料还对可解决肉牛、牦牛以及绵羊的腹胀、腹泻等问题。
[0003]随着抗生素在畜产品中的残留对人类健康的危害、过量排泄对环境的污染、长期使用导致耐药菌株的产生等问题日益被人们所重视，目前很多国家已经禁止或限制了抗生素在饲料中的使用，无抗、减抗畜禽产品将成为发展主流，而当前益生菌制剂作为安全、绿的饲料添加剂引起了极大的关注。开发具有强抑菌性、黏附性，强耐酸、耐胃肠道及耐胆盐能力，并能增强动物免疫力的益生菌菌株极具应用价值，而益生性能与其发酵的乳酸菌种类密切相关，因此获得优质的有特异功能的乳酸菌菌种是作为益生菌饲料添加剂最核心的技术。
[0004]为解决上述问题，寻一种安全绿的饲料添加剂是业内工作人员的一个工作方向。
发明内容
[0005]本发明提供一株植物乳杆菌。
[0006]本发明的一株植物乳杆菌，于2018年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO:15546。
[0007]本发明的的植物乳杆菌可在食草动物饲养中的应用，也可在制备食草动物的饲料
添加剂中的应用，还可在制备食草动物的饲料中的应用。
[0008]本发明的植物乳杆菌菌株，具有很强的黏附及抑菌能力，有很好的耐酸、耐胃肠道以及耐胆盐能力，能有效的防治牛羊腹泻病。
附图说明
[0009]图1FBL-3a的菌落形态图。
[0010]图2FBL-3a的革兰氏染图。
[0011]图3FBL-3a的PCR扩增片段图谱。
[0012]图4FBL-3a的生长以及发酵pH曲线图。
[0013]图5温度对菌FBL-3a生长的影响。
[0014]图6菌株FBL-3a黏附性。
[0015]图7植物乳杆菌标准株CICC6009黏附性。
具体实施方式
[0016]以下是结合附图详细阐述本发明的方案。
[0017] 1.菌株的分离
[0018]本发明植物乳杆菌FBL-3a(Lactobacillus plantarum FBL-3a)是从新疆肉牛粪便分离获得的。本发明的菌株分离纯化方法是：从新疆牦牛粪便稀释液中吸取1mL，分别稀释10-4，10-5，10-6次方，各取0.1mL涂布于含钙的MRS平板上，待稀释液被平板吸收后，37℃厌氧培养24h，挑选出具有溶钙圈疑似乳酸菌的单菌落12个，分别在MRS固体平板上划线纯化培养3次，各挑一单菌落于MRS液体培养基中37℃静置培养24h，取发酵菌液进行抗逆性以及体外益生特性试验，最终挑选出1株黏附性强及抑菌性好，有很好的耐酸、耐胃肠道及耐胆盐能力的菌株保存并命名为FBL-3a。于2018年4月2日提交并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO:15546。
[0019]本发明前述使用的培养基的配方如下：
[0020](1)MRS培养基(1L)：蛋白胨10.0g；牛肉浸粉10.0g；酵母浸粉5.0g；葡萄糖20.0g；吐温801.0mL；K2HPO4·3H2O 2.0g；无水乙酸钠5.0g；柠檬酸三铵2.0g；MgSO4·7H2O 0.29g；MnSO4·H2O 0.058g。(将以上成分加入蒸馏水中，定容到1000mL，加热溶解，调节pH 为6.3，分装后121℃高压灭菌20min。(注：固体培养基在此基础上加1.5％琼脂粉)
[0021](2)LB培养基(1L)：胰蛋白胨10g；氯化钠10g；酵母浸粉5g，琼脂20g，PH调节为7.5。[0022] 2.菌种的鉴定
[0023] 2.1菌种的形态观察
[0024]对菌FBL-3a进行菌落形态观察、参见图1，对菌株进行革兰氏染，其电子显微镜观察菌体形态参见图2。菌FBL-3a的主要形态特征如下：菌落圆，光滑，在含钙的MRS培养基上呈乳黄，不透明，菌落周围具有透明溶钙圈。革兰氏染显示阳性，菌体杆状，宽：0.5-0.6μm，长：1.2-3.0μm。
[0025]生理生化特征的鉴定：
[0026]菌FBL-3a生理生化特征见表1，具体为：明胶实验和吲哚实验显示阴性，奈试产氨实验为阳性，VP、MR、淀粉水解、过氧化氢实验显示阴性，说明该菌能分解利用大分子含氮物
质，不能将葡萄糖分解产生丙酮酸，不能产生淀粉酶将淀粉水解为糖类物质，不能利用明胶。同时菌FBL-3a能发酵利用α-乳糖、D-果糖、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖产酸，不产气。[0027]表1菌FBL-3a的生理生化特征
[0028]
[0029]注：生理学特征：(“+”表示阳性；“-”表示阴性)；糖类发酵实验结果记录表：(“+，+”表示产酸，产气；“-，-”表示不产酸，不产气。)
[0030] 2.2菌FBL-3a的分子生物学鉴定
[0031]①细菌基因组DNA的提取采用Takara公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取，提取后将DNA分装于EP管冻存于-20℃。②16S rDNA序列的PCR扩增，得到目的片段长约为1500bp (图3)。将含有目标片段的产物委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成测序，得到的实际有效核苷酸序列为1425bp，在NCBI数据中对各16S rRNA序列进行Blast比对分析，得到序列与Lactobacillus plantarum的序列同源性大于99％。将FBL-3a基因序列提交NCBI数据库中，进行细菌登入号的申请，申请得到的登录号为MH517566。
[0032]菌FBL-3a的16SrDNA基因序列：植物乳杆菌FBL-3a的16SrDNA基因序列为SEQ ID NO.6，结合菌FBL-3a的形态观察和生理生化实验，以及系统发育树中的同源性分析，确定菌FBL-3a为植物乳杆菌(Lactobacillus pLantarum)菌种。
[0033] 3.植物乳杆菌FBL-3a的微生物学特性研究
[0034] 3.1植物乳杆菌FBL-3a母液的制备
[0035]取100μL 30％甘油保存的植物乳杆菌FBL-3a接种于10mL的MRS液体培养基中，37℃静置培养24h，制成菌种母液备用。
[0036] 3.2植物乳杆菌FBL-3a生长以及发酵PH曲线测定，取3.1中植物乳杆菌FBL-3a母液(下同)各100μL分别接种于57管装有10mL MRS液体培养基的试管中，37℃静置发酵培养，以未接菌的液体培养基为对照，分别在发酵后0-96(h)的不同时间段内取3管测定菌体OD (600nm)值以及PH值，结果表明(图4)，菌FBL-3a发酵到10h时进入对数生长期，发酵到18h时进入稳定期，此时菌体OD(600nm)值为3.09±0.02。菌发酵到稳定期时pH已降低到4.17，且稳定期pH稳定在3.66左右。
[0037] 3.3植物乳杆菌FBL-3a最适发酵温度的测定
[0038]取植物乳杆菌FBL-3a母液各100μL分别接种于装有10mL MRS液体培养基的试管中，20、25、3
0、35、40、45、50(℃)静置发酵培养24h，测定发酵液OD600nm)值，结果表明(图5)，菌FBL-3a最适生长温度为35℃，菌体OD(600nm)值为3.66±0.02；菌在40℃时，OD (600nm)值仍然可到达3.02±0.02，发酵到50℃时菌的OD(600nm)值降到0.80±0.01处于基本不生长状态，说明该菌适合生长温度20-40℃。
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