(10)申请公布号 (43)申请公布日 2014.03.19
C N 103642917
A (21)申请号 201310647179.5
(22)申请日 2013.12.06
C12Q 1/68(2006.01)
(71)申请人南京市产品质量监督检验院
地址210019 江苏省南京市建邺区嘉陵江东
街3号
(72)发明人方昕 张驰 许磊 高翔 李晓丽
李宁 方翔 崔永刚
(74)专利代理机构北京市中闻律师事务所
11388
代理人王新发
常亚春
(54)发明名称
及检测方法
(57)摘要
一种鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒，由预
混液1和预混液2构成。该试剂盒鉴定鼠源性成
分具有良好的特异性，灵敏度可达到1pg/反应，
可成功地对肉类及其产品中的鼠源性成分进行鉴
定，可用于食品安全检测部门对肉类及其制品掺
假的监管与控制，具有显著的实用价值。
(51)Int.Cl.
权利要求书2页 说明书6页 附图1页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书2页 说明书6页 附图1页(10)申请公布号CN 103642917 A
1.一种鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒，其特征在于，由以下试剂构成：
预混液1，其包含Taqman荧光定量PCR 反应Taq酶1.25U, dNTP各0.2μM， PH8.5的
1.5 mM；储藏条件为4 ºC，保质期半年；
Tris-HCl 10 mM，KCl 50mM，MgCl
2
预混液2，其包含引物A 2μM, 序列为5'-CCGCCCAATCACCCAAA-3'，引物B 2μM，序列为5'-GCCTCCGATTCATGTTAAGA-3'，序列荧光探针C4μM，序列为5'-FAM-TACTGAATYCTAGTAG CCAAC-TAMRA-3', 荧光探针D 4μM，序列为5'-CY5-TGGTCTTCTTAGCGAGAGTG-TAMRA-3'，以及内参核酸 0.005ng/μL；储藏条件为-20 ºC，避光，保质期半年。
2.一种鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S21、提取常见鼠肉DNA并制作模板，进行扩增反应，对扩增产物进行测序；
S22、鼠肉测序结果与其他肉类DNA的同源基因比对，筛选出鼠类特异序列，设计相应的引物和荧光探针；
S23、设计阳性内参，消除反应体系中假阴性；
S24、验证方法的特异性，优化反应条件，制作试剂盒；
S25：使用梯度稀释的目标物种DNA，确定反应体系的检测灵敏度。
3.如权利要求２所述的鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒的制备方法，其特征在于，
步骤S21具体包括：反应体系为25μL，其中包括12.5μL premix Taq (2X, Takara, version 2.0), 0.5μL 10μM Seq 正、反向引物, 100ng 模板DNA 和ddH
O；反应条件为
2
95℃预变性3min；30个循环的95℃ 30s、50℃ 30s、72℃ 1min；72℃延伸7min。
4.如权利要求２所述的鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒的制备方法，其特征在于，
步骤S22具体包括：探针的3’端用发光基团FAM标记，5’端用淬灭基团BHQ标记；在探针合成中等量分配两种碱基C/T。
5.如权利要求２所述的鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒的制备方法，其特征在于，
步骤S23具体包括：阳性内参是由质粒pUC57插入一段重组基因构成；重组基因的序列为5’-CCGCCCAATCACCCAAATTGGTCTTCTTAGCGAGAGTGGCTGTCACGGGATTCGCTAAAATTCCCAGCGA AACCAGGCGGGAGTCTGGACACGTCGTTGGTACCATGATGAAGTGGCTGACATGATCACCGCGATGCGCCCAGGACA TAATCTTAACATGAATCGGAGGC-3’。
6.如权利要求２所述的鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒的制备方法，其特征在于，
步骤S24具体包括：反应体系为20μL，其中包括Taq酶1.25U, dNTP各0.2μM， PH8.5
1.5 mM, 10μM引物A、B各0.4μL, 0.8μL 10μM 的Tris-HCl 10 mM，KCl 50mM，MgCl
2
探针C, 0.8μL 10μM 内参探针D, 0.2μL ROX dye II (Takara, version 2.0)，100ng 模板DNA和ddH
O；反应条件为95℃预变性10min；30个循环的95℃5s、55℃30s、60℃
2
20s。
7.一种鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S31：取肉或肉产品中提取的DNA 1μL 与17μL 预混液1，2μL预混液2在冰上混合均匀；
S32：将混合好的试剂至于荧光定量PCR仪进行反应；
S33：当内参CY5荧光信号在Ct值35左右发生扩增，说明PCR体系反应良好。
8.如权利要求７所述的鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒的的检测方法，其特征在于，
步骤S32具体包括：反应条件设为：95°C 预变性10 min, 40个循环的95°C 5s、
55°C 30s，最后保存于4°C。
鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒、制备方法及检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒、制备方法及检测方法，尤其是一种特异性好，灵敏度高的鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒、制备方法及检测方法。
背景技术
[0002] 近年来，不法商贩利用廉价的肉类冒充高价牛、羊肉的肉类掺假事件频发。更为严重的是，近期市面上出现了用来源不明的鼠肉冒充羊肉的恶性案例，引起社会各界广泛关注。鼠肉掺假不仅影响了肉类产品市场的正常运行，更造成了严重食品安全隐患。老鼠多生活于潮湿脏乱的环境中，携带多
种细菌病毒。死鼠肉极易腐烂而滋生细菌，一些死鼠体内还含有老鼠药等强力毒药成分。因此，一旦老鼠肉被混掺入食用肉类及肉制品，食用后会造成人体中毒，轻则恶心、呕吐，重则可能导致死亡。
[0003] 以聚合酶链反应（PCR）为基础的检测技术已成为食品溯源，尤其是肉类种属鉴别的核心技术。该技术针对不同物种基因序列的差异，设计特异性的引物，利用PCR扩增反应实现食品中特征基因片段的指数级扩增，从而鉴别食品中的物种来源。实时荧光PCR的发展和应用提高了食品溯源方法的灵敏度，并为肉类及肉制品定量定性分析提供技术支持。目前，基于线粒体基因设计特异性的引物而建立PCR法和实时荧光PCR的方法已见大量报道，市面上已有许多利用此类方法检测肉及肉制品源性的试剂盒，在肉制品掺假控制与监管中发挥了重要作用。
[0004] 然而，此类试剂盒多用于对肉制品中牛、羊、猪及禽类等源性的检测，而针对肉制品中鼠源性成分的检测的试剂盒还未有所见。在国外，已有运用普通PCR鉴别啮齿目物种源性的研究，但经过试验验证，该研究中针对啮齿目所设计的引物对猪、牛、羊等常见肉类均可以发生扩增反应，特异性差。在国内，目前市面上出现了针对海狸鼠源性成分的鉴定试剂盒。该试剂盒采用普通PCR方法，操作步骤繁琐，在灵敏度和特异性上都有一定的局限性。同时，在分类学上海狸鼠并不属于鼠科，而在国内某些地区，海狸鼠被视为可食用的肉类，因此使用海狸鼠掺假肉制品的危害性远小于本发明中调研选取的鼠科样本。
[0005] 为了弥补鼠源性成分鉴定试剂盒的市场空缺，丰富肉制品掺假检测方法，我们开发了肉及肉制品中鼠源性成分检测的高灵敏度试剂盒。本发明针对生活中常见的可能掺假肉制品的鼠类，基于实时荧光定量PCR技术，设计鼠源性引物探针，具有良好的针对3种常见鼠肉的特异性，与其他肉类无交叉反应，灵敏度高达1皮克/反应，且总检测时间可控制在2小时以内，对肉制品掺假的监管和控制有着重要的意义。
发明内容
[0006] 为了对肉制品掺假进行监管和控制，本发明提供了一种特异性好，灵敏度高的鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒、制备方法及检测方法。
[0007] 为实现该目的，本发明提供了一种鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒，由以下试剂构成：
预混液1，其包含Taqman荧光定量PCR 反应Taq酶1.25U, dNTP各0.2μM，PH8.5的
1.5 mM；储藏条件为4 ºC，保质期半年。
Tris-HCl 10 mM，KCl 50mM，MgCl
2
[0008] 预混液2，其包含引物A 2μM, 序列为5'-CCGCCCAATCACCCAAA-3'，引物B 2μM，序列为5'-GCCTCCGATTCATGTTAAGA-3'，序列荧光探针C4μM，序列为5'-FAM-TACTGAATYCT AGTAGCCAAC-TAMRA-3', 荧光探针D 4μM，序列为5'-CY5-TGGTCTTCTTAGCGAGAGTG-TAMRA-3'，以及内参核酸 0.005ng/μL；储藏条件为-20 ºC，避光，保质期半年。
[0009] 本发明还提供了一种鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S21、提取常见鼠肉DNA并制作模板，进行扩增反应，对扩增产物进行测序；
S22、鼠肉测序结果与其他肉类DNA的同源基因比对，筛选出鼠类特异序列，设计相应的引物和荧光探针；
S23、设计阳性内参，消除反应体系中假阴性；
S24、验证方法的特异性，优化反应条件，制作试剂盒；
S25：使用梯度稀释的目标物种DNA，确定反应体系的检测灵敏度。
[0010] 优选地，步骤S21具体包括：反应体系为25μL，其中包括12.5μL premix Taq (2X, Takara, version 2.0), 0.5μL 10μM Seq 正、反向引物, 100ng 模板DNA 和ddH
O；反应条件为95℃预变性3min；30个循环的95℃ 30s、50℃ 30s、72℃ 1min；72℃延2
伸7min。
[0011] 优选地，步骤S22具体包括：探针的3’端用发光基团FAM标记，5’端用淬灭基团BHQ标记；在探针合成中等量分配两种碱基C/T。
[0012] 优选地，步骤S23具体包括：阳性内参是由质粒pUC57插入一段重组基因构成；重组基因的序列为5’-CCGCCCAATCACCCAAATTGGTCTTCTTAGCGAGAGTGGCTGTCACGGGATTCGCTAAAA TTCCCAGCGAAACCAGGCGGGAGTCTGGACACGTCGTTGGTACCATGATGAAGTGGCTGACATGATCACCGCGATGC GCCCAGGACATAATCTTAACATGAATCGGAGGC-3’。
[0013] 优选地，步骤S24具体包括：反应体系为20μL，其中包括Taq酶1.25U, dNTP各
0.2μM，PH8.5的Tris-HCl 10 mM，KCl 50mM，MgCl
1.5 mM, 10μM引物A、B各0.4μL,
2
0.8μL 10μM 探针C, 0.8μL 10μM 内参探针D, 0.2μL ROX dye II (Takara, version 2.0)，100ng 模板DNA和 ddH2O；反应条件为95℃预变性10min；30个循环的95℃5s、55℃ 30s、60℃ 20s。
[0014] 本发明亦提供了一种鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
S31：取肉或肉产品中提取的DNA 1μL 与17μL 预混液1，2μL预混液2在冰上混合均匀；
S32：将混合好的试剂至于荧光定量PCR仪进行反应；
S33：当内参CY5荧光信号在Ct值35左右发生扩增，说明PCR体系反应良好。[0015] 优选地，步骤S32具体包括：反应条件设为：95°C 预变性10 min, 40个循环的95°C 5s、55°C 30s，最后保存于4°C。
[0016] 本发明基于实时荧光定量PCR技术，设计了食品中鼠源性成分鉴定的试剂盒。提取食品中的总DNA后，应用试剂盒预混液中所包含的鼠源性成分特异引物及探针，进行PCR
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