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一种用于个人安全用药指导的试剂盒的制作方法

seq id no.101所示。
8.进一步的本发明还包含扩增rs1065852、rs35742686、rs887829所包含正、反向引物如seq id no.47-seq id no.55所示进一步的本发明还包含鉴定上述3个基因位点突变的基因探针如seq id no.102-seq id no.104。
9.进一步的rs4244285、rs4986893、rs12248560、rs1057910、rs1799853、rs16947、rs28371725、rs3892097、rs5030655、rs28399433、rs762551、rs3745274、rs2070673、rs7909236、rs2740574、rs4986910、rs776746、rs3918290、rs1050828、rs4149056、rs4148323、rs1801280、rs9923231等23个基因探针的5’端标记有fam或hex荧光报告基团，3’端有mgb非荧光淬灭基团；rs1065852、rs35742686、rs887829等3个基因探针的5’端标记有fam荧光报告基团，3’端有bhq1荧光淬灭基团。
10.进一步的本发明还包含pcr反应缓冲液和taq酶。
11.进一步的本发明还包含阳性质控品，所述阳性质空品为含有扩增目的基因片段的重组质粒。
12.进一步的本发明还包含阴性质控品，所述阴性质空品为depc水。
13.进一步的本发明还涉及一种对个人安全用药检测的方法包括使用本发明的引物对、探针或者试剂盒的步骤。
14.在本发明的一个具体实施方案中，所述的个人安全用药检测的方法，包括下述步骤：1）提取患者的基因信息，一般是抗凝的全血或fta血卡等所提取的人基因组dna；2）特定片段扩增，采用上述引物对对待测样品的目的基因进行pcr扩增3）利用taqman探针对扩增产物进行特异性微点检测，根据pcr扩增后荧光信号的强弱对所检测基因位点进行定性分析。
15.上述方法中rs4244285、rs4986893、rs12248560、rs1057910、rs1799853、rs16947、rs28371725、rs3892097、rs5030655、rs28399433、rs762551、rs3745274、rs2070673、rs7909236、rs2740574、rs4986910、rs776746、rs3918290、rs1050828、rs4149056、rs4148323、rs1801280、rs9923231等23个基因位点的pcr扩增的反应体系如下：94
°
c预变性4分钟；按94
°
c 20秒，60
°
c 30秒，72
°
c 30秒，扩增反应45个循环。
16.rs1065852、rs35742686、rs887829等3个基因位点的pcr扩增的反应体系如下：94
°
c预变性4分钟；按94
°
c 15秒，65
°
c 45秒扩增反应10个循环；再按94
°
c 15秒，60
°
c 45秒扩增反应35个循环。
17.药物进入机体后会产生两种作用，即作用和不良反应。大量生物医学研究结果证明，绝大部分药物反应的个体差异是由遗传因素造成的，药物在人体内的疗效和毒副作用与若干dna密切相关。因人施药，是医学发展的必然方向。在我国使用降压药的患者中，仅30%血压控制在适合水平，抗心律失常药的有效性只有50%左右；全国药物性耳聋患者达35万，使用链霉素、卡那霉素、庆大霉素等抗生素时“一针致聋”，许多人携带药物敏感性基因突变而不自知。
18.本发明根据人体自身染体上的基因位点多态性，经过仔细研究和挑选，确定了卫健委公布的26个基因位点，全面涵盖了主要的药物、转运、作用靶点的基因，预测该个体在使用某种药物时的安全性。参考检测的结果，医生可以在开处方时，在药品选择、剂量控
制及联合用药等方面提出适合每个患者自己的个体化用药方案，患者也可以作为自己日常用药，阅读药品，咨询药量时的健康管理助手，最终可以达到提高药物疗效、降低药物毒副作用、减少盲目的医疗费用支出。本发明是国内首个一次性直检26个基因药物位点的检测技术，将检验时间缩短到2天内，而其它方法的检测，需要1-3个月。
具体实施方式
19.【检测原理】rs4244285、rs4986893、rs12248560、rs1057910、rs1799853、rs16947、rs28371725、rs3892097、rs5030655、rs28399433、rs762551、rs3745274、rs2070673、rs7909236、rs2740574、rs4986910、rs776746、rs3918290、rs1050828、rs4149056、rs4148323、rs1801280、rs9923231等23个基因位点针对snp位点不同的基因型分别设计taqman探针，其中每一条探针采用不同的荧光标记（fam和hex），分别对应一个基因型，当进行实时荧光定量pcr扩增时，只有探针序列与模板完全匹配时，才能发生退火结合，从而进行切割产生荧光信号；当探针序列与模板序列不匹配时，不能产生退火结合，不产生荧光信号。通过实时监测并记录荧光信号，从而得到不同的扩增曲线，判断出不同的基因型。
20.rs1065852、rs35742686、rs887829等3个基因位点采用突变扩增系统又称等位基因特异性扩增法，其基本原理是，如果引物3’端碱基与模板碱基不互补，则taq-dna聚合酶扩增效率明显抑制，因此根据已知位点突变设计不同的引物，其3’端碱基分别与突变和正常的模板碱基互补，由于taq-dna聚合酶缺少3
′→5′
外切酶活性，因此对于3
′
末端错配的引物，扩增效率、速度和产物积累会受到很大的影响，通过taqman探针实时监测并记录，通过ct值和扩增曲线的结果可以判断不同的基因型。
[0021] 【主要组成成份】
【储存条件和有效期】储存条件：-20
±
2℃避光保存，避免反复冻融，开瓶后请在2周内使用完。有效期：6个月。
[0022]
【适用仪器】stratagene mx3000p/3005p、abi step one/step one plus/7300/7500、roche480、bio-rad cfx96等多荧光pcr仪。
[0023]
【样本要求】1.适用样本类型：乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid, edta）抗凝的全血、fta血卡等所提取的人基因组dna，dna的od260/od280值需在1.7～2.0之间，以确保dna的纯度；2.样本采集：全血：常规采血2ml，注入5ml无菌edta于抗凝管中，立即轻轻颠倒管子混合，密闭送检；3.保存和运输：采集的全血样本可立即进行基因组dna的提取，以供检测。若采集的全血样本暂时不用于检测，可在-20℃下保存，但不超过1个月；全血样本运输时采用泡沫箱加冰。
[0024]
【检验方法】1.样本处理和核酸提取1.1 利用商品化的dna提取试剂盒处理样本，具体操作步骤和注意事项参见该试剂盒说明书，提取后的dna即可进行检测；1.2 试剂盒的阳性质控品、阴性质控品无需抽提，使用前室温融化混匀。
[0025]
2.试剂配制2.1 配制说明（1）在试剂准备区内将盒内各组分取出，于室温充分融化之后，短暂震荡，瞬时离心；（2）确定反应数n（配制时需考虑物料的损耗），n=待检样本数(n)+阳性质控品数(1)+阴性质控品(1)，计算加到反应混合物中的量，对于每一个引物探针液都是如此，计算如下：
（3）取1.5ml离心管（无菌和 d\rnase-free）分别配制各位点的反应体系并做好标识，混合液震荡混匀，瞬时离心；（4）然后将上述混合液6.6μl/管分装至pcr反应管中（无菌和d/rnase-free）；（5）将阳性质控品、阴性对照和已提取的人基因组dna 3.4μl分别加入pcr反应管中，盖紧管盖（避免气泡产生），瞬时离心将管壁上的液体全部甩至管底，然后立即进行pcr扩增反应；（6）建议将同一样品不同基因型的pcr扩增管相邻放置，便于分析结果。
[0026]
3.pcr反应条件在abi系列、stratagene系列及rochepcr等多荧光pcr仪上设定如下扩增循环条件及荧光采集程序：（1）rs4244285、rs4986893、rs12248560、rs1057910、rs1799853、rs16947、rs28371725、rs3892097、rs5030655、rs28399433、rs762551、rs3745274、rs2070673、rs7909236、rs2740574、rs4986910、rs776746、rs3918290、rs1050828、rs4149056、rs4148323、rs1801280、rs9923231的23个基因位点引物与探针的反应体系如下：（2）rs1065852、rs35742686、rs887829等3个基因位点引物与探针的反应体系如下：4.荧光检测通道的设定rs4244285、rs4986893、rs12248560、rs1057910、rs1799853、rs16947、rs28371725、rs3892097、rs5030655、rs28399433、rs762551、rs3745274、rs2070673、rs7909236、rs2740574、rs4986910、rs776746、rs3918290、rs1050828、rs4149056、rs4148323、rs1801280、rs9923231等23个基因位点特异性探针采用的报告基团为fam/hex（目的荧光），淬灭基团mgb-nfq。样本荧光信号设置需按荧光定量pcr仪说明书进行操作，发
光基团选择fam和hex（如果无hex也可选择vic），淬灭基团相应选择mgb-bhq（若无可选择 none），pcr循环72℃延伸收集荧光信号。
[0027]
rs1065852、rs35742686、rs887829等3个基因位点采用的报告基团为fam，淬灭基团为bhq1。样本荧光信号设置需按荧光定量pcr仪说明书进行操作：发光基团选择fam，淬灭基团若无相应选项可选择none，pcr循环第二步60℃是收集荧光信号。
[0028]
5.数据处理反应完毕，存储结果以便进行数据处理。pcr扩增完成后，应及时废弃扩增反应管，且绝对禁止打开反应管盖，以避免扩增产物形成气溶胶污染对以后的检测造成结果混乱。
[0029]
【参考值范围】1、基线及阈值的确定：基线需设置在pcr扩增反应最初荧光信号变化不大（建议取6-15）的数个循环内，接近一条直线；荧光阈值设置时一般是3~15个循环的荧光信号的标准偏差的十倍，反应前 15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号，当存在背景信号过高时，可采用手动设置基线，阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品的荧光曲线最高点。
[0030]
2、仪器的设定及校准：选择相应样品类型，包括unknown、阴性质控品等。
[0031]
3、阴性质控品fam/hex通道无s型扩增曲线；阳性质控品的基因型需与给定的基因型相一致。
[0032]
【检验结果的解释】在rs4244285、rs4986893、rs12248560、rs1057910、rs1799853、rs16947、rs28371725、rs3892097、rs5030655、rs28399433、rs762551、rs3745274、rs2070673、rs7909236、rs2740574、rs4986910、rs776746、rs3918290、rs1050828、rs4149056、rs4148323、rs1801280、rs9923231的23个基因位点中以rs4244285位点在荧光pcr仪上的扩增曲线为例（a-fam/g-hex），当两条扩增曲线同时呈现明显的上升状态时，结果判读为杂合基因型，如图1；当两条扩增曲线中只有一条呈现明显的上升状态时，则判读为上升曲线的基因为纯合基因型，如图2、图3。
[0033]
rs1065852、rs35742686、rs887829等3个基因位点以rs1065852位点的a、g基因型的扩增曲线为例，等位基因之间有明显的ct值差值时（相差大于2个ct值），结果为ct值较小的引物探针对应基因的纯和基因型，如图4、图5；等位基因之间扩增曲线重合（ct值差值小于1），结果判读为杂合基因型，如图6。
[0034]
【检测方法的局限性】1.本产品采用arms-pcr方法测定基因分型，对于在引物探针处发生非设定的突变可能会影响结果判断；2.本产品对于试剂盒引物并未涉及到的稀有突变的基因型无法得到准确的分析结果；3.实验室环境污染、试剂污染和样本交叉污染可能会出现结果难以判断或不易分辨。
[0035]
【产品的性能指标】1.本试剂盒采用 fam/hex标记，适用样本广泛，适用于多种机型；2.本试剂盒对人其他基因组无非特异扩增；3.阳性质控品不得出现假阴性，符合率 100%；阴性质控品不得出现假阳性，符合
率 100%；4.由于试剂保存不当、配制不准确、反复冻融次数太多；样本浓度过低（≤10ng/μl）、纯度不高（od260/od280值≤1.7 or ≥2.0）等会影响试剂的检测效能，出现结果不易分辨的情况，若出现此情况可根据试验的具体情况具体分析，建议选取阳性质控的扩增曲线图作为参照。
[0036]
案例一郝女士因病需用药故做此检测，试剂盒检测结果如下：根据上述结果我们做出如下判断：禁用药物无慎用药物
禁用药物表示携带特定基因型，使用这个药物发生不良反应或者无效的风险很高；慎用药物表示携带的基因型会使用药后发生不良反应或者无效的风险高于平均水平，如有可能建议使用替代药物；检测结果显示大部分药物都可以正常使用，但仍需注意慎用药物的使用。
[0037]
案例二向女士为糖尿病患者，需要长期用药故做此检测，试剂盒检测结果如下：
根据结果我们做出如下判断：禁用药物慎用药物
禁用药物表示携带特定基因型，使用这个药物发生不良反应或者无效的风险很高；慎用药物表示携带的基因型会使用药后发生不良反应或者无效的风险高于平均水平，如有可能建议使用替代药物；检测结果显示，在日常用药中应格外注意呼吸系统药物、抗肿瘤药物、激素药物这三类药物。这三类系统药物中，氨茶碱、茶碱、长春瑞滨、地屈孕酮都不能使用，但它们属于临床常见药物，如遇到这类疾病，请向处方医生说明此类情况。

技术特征：

1.一种用于个人安全用药指导的试剂盒，其特征在于，该试剂盒可以对指定的rs4244285、rs4986893、rs12248560、rs1057910、rs1799853、rs16947、rs28371725、rs3892097、rs5030655、rs28399433、rs762551、rs3745274、rs2070673、rs7909236、rs2740574、rs4986910、rs776746、rs3918290、rs1050828、rs4149056、rs4148323、rs1801280、rs9923231、rs1065852、rs35742686、rs887829等26个基因位点中的一部分或者全部进行snp基因分型的检测。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒中包括扩增权利要求1中所述26个基因位点的上下游引物，序列如seq id no.1-seq id no.55所示。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒中包括检测权利要求1中所述26个基因位点的探针，序列如seq id no.56-seq id no.104所示。4.根据权利要求3所述的探针，其特征在于，rs4244285、rs4986893、rs12248560、rs1057910、rs1799853、rs16947、rs28371725、rs3892097、rs5030655、rs28399433、rs762551、rs3745274、rs2070673、rs7909236、rs2740574、rs4986910、rs776746、rs3918290、rs1050828、rs4149056、rs4148323、rs1801280、rs9923231等23个基因位点的探针seq id no.56-seq id no.101荧光报告基团为 fam/hex,非荧光淬灭基团为mgb-nfq；rs1065852、rs35742686、rs887829等3个基因位点的探针no.102-seq id no.104荧光报告基团为 fam,荧光淬灭基团为bhq1。5.一种用于个人安全用药指导的试剂盒，其包含权利要求1-4中任一项所述的基因位点、引物对和探针的组合产品。6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中，还包含pcr反应缓冲液和 taq 酶。7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中，还包含阳性质控品和阴性质控品，所述阳性质控品为含有扩增目的基因片段的重组质粒；所述阴性质控品为depc 水。8.一种用于个人安全用药知道的检测方法,其特征在于,采用权利要求1-4任一项所述基因位点、引物对和探针的组合产品进行pcr扩增,利用探针对扩增产物进行特异性微点检测，根据pcr扩增后荧光信号的强弱对目的基因进行定性或定量检测。9.如权利要求8所述的方法,其特征在于,所述rs4244285、rs4986893、rs12248560、rs1057910、rs1799853、rs16947、rs28371725、rs3892097、rs5030655、rs28399433、rs762551、rs3745274、rs2070673、rs7909236、rs2740574、rs4986910、rs776746、rs3918290、rs1050828、rs4149056、rs4148323、rs1801280、rs9923231等23个基因位点的pcr扩增的条件为:94
°
c预变性4分钟；按94
°
c 20秒，60
°
c 30秒，72
°
c 30秒，扩增反应45个循环；rs1065852、rs35742686、rs887829等3个基因位点的pcr扩增的条件为：94
°
c预变性4分钟；按94
°
c 15秒，65
°
c 45秒扩增反应10个循环；再按94
°
c 15秒，60
°
c 45秒扩增反应35个循环。10.权利要求1-4任一项所述引物对和探针的组合产品或者权利要求4-7任一项所述的试剂盒在个人安全用药检测中的用途。

技术总结

本发明提供一种用于个人安全用药检测的试剂盒，该试剂盒公开了可同时对26个基因位点进行SNP分型的引物对和探针的组合产品，以及检测方法。所述试剂盒包括用于检测26个基因位点的正反扩增引物，所述扩增引物的序列如SEQIDNO.1～SEQIDNO.55，探针的序列如SEQIDNO.56-SEQIDNO.104所示。本发明在对大量样本进行数据统计基础上，经过仔细研究和挑选，确定了卫健委公布的26个基因位点，全面涵盖了主要的药物、转运、作用靶点的基因，预测该个体在使用某种药物时的安全性。本试剂盒可以在确保检测准确性、特异性、及时性的基础上，能够有效的节约成本，可进行推广。本发明是国内首个一次性直检26个基因药物位点的检测技术，将检验时间缩短到2天内，亦可提供一定的参考价值和临床指导意义。价值和临床指导意义。