人参皂苷Rh4-生物素活性分子探针及其制备方法和应用

人参皂苷rh
4-生物素活性分子探针及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于活性小分子探针制备领域，主要涉及一种人参皂苷rh
4-生物素活性小分子探针及其制备和应用。

背景技术：

2.神经退行性疾病主要包括阿尔茨海默病(ad)、帕金森疾病(pd)以及亨廷顿病(hd)。 ad主要表现为进行性认知衰退和记忆丧失；pd临床表现为静止性震颤、肌强直、运动功能减退和步态异常；hd是一种常染体显性的神经退行性疾病，由huntingtin基因中多谷氨酰胺编码的cag重复序列的扩展引起。目前临床上常用神经疾病的药物，主要包括营养神经类药物，改善微循环，改善大脑认知状态的药物。三七皂苷是从中药三七中提取分离得到的具有多种药理活性成分，其中人参皂苷rh4具有降糖和抗肿瘤作用，但其神经退行性疾病的作用尚未有报道。
3.基于活性的蛋白质组分析主要是基于活性小分子探针abp(activity-based probe)来识别药物活性成分作用靶点的技术。abp是基于活性成分结构改造而成的探针，abp带的标签不同发挥的作用不同，最主要的功能是成像定位功能和结合富集功能。决定abp功能主要是由其标签决定，如连接上亲和标签，发挥的是富集功能，从而开展后续的靶点验证、机理研究等。通过连接生物素标签，发挥其成像定位功能，从而实现对靶标蛋白的可视化、高通量检测。基于活性的蛋白质组分析构建活性分子探针研究人参皂苷rh4的神经保护作用潜在靶点及机制尚未有报道。

技术实现要素：

4.本发明的目的是为了探究人参皂苷rh4的神经保护作用潜在靶点，进而发掘其作用机制而提供了一种人参皂苷rh
4-生物素活性小分子探针，该探针能高效、灵敏地与靶点蛋白相结合，然后进行富集，从而得到潜在的靶点蛋白，本探针能为靶点研究提供一个有利的工具。
5.本发明提供一种结构式如下式所示的人参皂苷rh
4-生物素活性小分子探针：
6.式中，最右侧连接的基团为生物素，其作为活性小分子探针中的报告基团。
7.本发明所述的活性小分子探针主要针对人参皂苷rh4侧链进行改造，通过酯化、氧化、酰胺化合成，生物素作为探针的报告基团。
8.本发明所述的人参皂苷rh
4-生物素活性小分子探针的制备方法如下：
9.(1)羟基保护:将原料人参皂苷rh4、乙酸酐、催化剂dmap溶于吡啶，于室温中搅拌反应24h，减压浓缩后，浓缩物加入乙酸乙酯复溶，在复溶物中加入盐酸、饱和nacl溶液、 up水进行萃取，去除残留吡啶，保留乙酸乙酯层，使用旋转蒸发仪减压蒸发溶剂，得到产物 1；
10.所述产物1为
11.原料人参皂苷rh4与乙酸酐摩尔比为1:7，dmap与原料人参皂苷rh4的摩尔比为 1:0.5；
12.(2)双键氧化:将产物1溶于异丙醇中，水浴加热至70℃搅拌，随后缓慢滴加入高锰酸钾-丙酮溶液，反应8h，加入乙醇消耗剩余高锰酸钾终止反应，过滤，滤液使用旋转蒸发仪减压蒸发溶剂，得到产物2；
13.所述产物2为
14.所述高锰酸钾-丙酮溶液是高锰酸钾质量浓度为0.5％的丙酮溶液，高锰酸钾-丙酮溶液的添加量是为1.1-1.2当量。
15.(3)羟基脱保护:将产物2溶于甲醇中，在0℃下缓慢滴加入0.5mol/l氢氧化钠溶液，滴加结束后，65℃下回流反应，待反应完全后加入0.5mol/lhcl溶液调节ph＝5～6，用二氯甲烷萃取，收集有机相，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液加入活性炭搅拌，过滤，滤液使用旋转蒸发仪减压蒸发溶剂，得到产物3；
16.所述产物3为
17.所述氢氧化钠与产物2的摩尔比为1:86(每10mg产物2使用2ml0.5mnaoh溶液)
18.(4)酰胺化连接:将产物3溶于dmf-ch2cl2混合溶剂中，加入催化剂和生物素-氨基，室温反应24h，反应后溶液用水稀释，加入二氯甲烷萃取，收集二氯甲烷相，二氯甲烷相用饱和食盐水洗涤，再次收集有机相，使用旋转蒸发仪减压蒸发溶剂，最终得到产物4，即为人参皂苷rh4-生物素活性小分子探针；
19.所述生物素-氨基为
20.所述产物4为
21.所述dmf-ch2cl2混合溶剂是dmf与ch2cl2按体积比1:1混合制得，生物素-氨基与产物3的摩尔比为1:1.1。所述催化剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edci)、 4-二甲氨基吡啶(dmap)、1-羟基苯并三唑(hobt)和n,n-二异丙基乙胺(diea)。
22.本发明另一目的是将人参皂苷rh
4-生物素活性小分子探针应用在制备神经保护药物中的应用。
23.本发明提供了人参皂苷rk4在制备神经保护药物中应用，神经疾病包括抑郁症、焦虑症以及神经退行性疾病等。
24.本发明中人参皂苷rh4和人参皂苷rh4活性探针对h2o2诱导shsy-5y细胞损伤具有保护作用。本探针可用于探索人参皂苷rh4在神经疾病中存在的潜在靶点，为探明其神经疾病的机制提供了新方法。
具体实施方式
25.下面通过实施例对本发明方法作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中试剂如无特殊说明，均为常规试剂或按常规方法配制的试剂；
26.实施例1：人参皂苷rh
4-生物素活性探针的制备
27.步骤1：羟基保护
28.称取原料人参皂苷rh4(100mg，0.217mmol)加入圆底烧瓶，加入乙酸酐(150μl， 1.352mmol)、催化剂dmap(3mg，0.025mmol)溶于吡啶，于室温中搅拌反应24h，减压浓缩后，浓缩物加入乙酸乙酯复溶，在复溶物中加入对复溶物使用盐酸、饱和nacl溶液、 up水进行萃取，去除残留吡啶，保留乙酸乙酯层，使用旋转蒸发仪减压蒸发乙酸乙酯，得到产物1；
29.步骤2：双键氧化
30.将产物1溶于异丙醇中，水浴加热至70℃，搅拌，随后，将高锰酸钾-丙酮溶液(高锰酸钾质量浓度为0.5％的丙酮溶液)0.6ml缓慢滴加至产物1溶液中，反应8h，加入乙醇消耗剩余高锰酸钾终止反应，过滤，滤液使用旋转减压蒸发去除溶剂后得到产物2；
31.步骤3：羟基脱保护
32.将产物2溶于甲醇中，在0℃下缓慢滴加0.5mol/l氢氧化钠溶液2ml，滴加结束后，在70℃下回流反应，待反应完全后加入0.5mol/l hcl调节ph＝5～6，用二氯甲烷萃取，收集二氯甲烷有机相，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液加入活性炭搅拌30min，过滤，滤液使用旋转蒸发仪减压蒸发去除二氯甲烷，得到产物3；
33.步骤4：酰胺化连接
34.取产物3(0.1mmol)、edci(0.2mmol)、dmap(0.2mmol)、hobt(0.2mmol)、生物素-氨基(0.1mmol)、100μldiea，反应溶剂用dmf-ch2cl2混合溶剂(dmf:ch2cl2＝1:1) (4ml)，室温反应24h，反应后溶液用水稀释，再用二氯甲烷萃取，收集二氯甲烷有机相，二氯甲烷相用饱和食盐水洗，使用旋转蒸发仪减压蒸发去除二氯甲烷，得到最终产物4；
35.终产物4经1h-nmr和
13
c-nmr测定，确定化合物的结构为
36.实施例2：人参皂苷rh4和人参皂苷rh4活性探针的神经保护作用
37.本实施例研究了人参皂苷rh4活性探针对sh-sy5y细胞存活率的影响，采用cck8 法检测细胞增殖活性，取对数生长期sh-sy5y细胞，接种于96孔板内，放入培养箱(5％co2、 37℃)中培养至贴壁，模型组和给药组分别加入含300μmo1/lh2o2的dmem/f12完全培养液，37℃条件下孵育1h后，向sh-sy5y细胞中分别加入10μmol/l、20μmol/l、30μmol/l 的人参皂苷rh4、人参皂苷rh
4-生物素活性小分子探针样品培养24h；并设置不添加人参皂苷 rh4或小分子探针的空白组，干预后加入cck8溶液10μl/孔，孵育2h后采用酶标仪测定在 450nm处的吸光度值，计算细胞存活率,细胞存活率％＝(a
模型组/给药组
/a
空白组
)
×
100％。
38.结果见表1，与空白对照组相比，h2o2诱导shsy-5y细胞生存率显著降低(p《0.001)；与模型组相比，人参皂苷rh4和人参皂苷rh4活性探针能够呈浓度依赖性地提高shsy-5y细胞生存率(p《0.05,p《0.01,p《0.001)。给药两组相比，在10、30μmol/l浓度下，人参皂苷 rh4活性探针对shsy-5y细胞的增殖活性显著高于人参皂苷rh4(p《0.01,p《0.001)。以上结果说明，人参皂苷rh4和人参皂苷rh4活性探针对h2o2诱导shsy-5y细胞损伤具有保护作用。
39.表1人参皂苷rh4和人参皂苷rh4活性探针提高h2o2诱导神经母瘤细胞shsy-5y的细胞存活率 (n＝3)
40.注：与空白组相比，
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p《0.001；与模型组相比，
***
p《0.05，
***
p《0.01，
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p《0.001。rh4组vs rh4探针组，p《0.01，p《0.001。

技术特征：

1.结构式如下式所示的人参皂苷rh
4-生物素活性小分子探针：2.权利要求1所述的人参皂苷rh
4-生物素活性小分子探针的制备方法，其特征在于，步骤如下：(1)羟基保护:将人参皂苷rh4、乙酸酐、催化剂dmap溶于吡啶，于室温中搅拌反应24h后，减压浓缩，浓缩物加入乙酸乙酯复溶，在复溶物中加入盐酸、饱和nacl溶液、up水进行萃取，去除残留的吡啶，保留乙酸乙酯层，减压蒸发乙酸乙酯，得到产物1；产物1：(2)双键氧化:将产物1溶于异丙醇中，水浴加热至70℃搅拌，随后缓慢滴加入高锰酸钾-丙酮溶液，反应8h，加入乙醇消耗剩余高锰酸钾终止反应，过滤，滤液使用旋转蒸发仪减压蒸发溶剂，得到产物2；产物2：(3)羟基脱保护:将产物2溶于甲醇中，在0℃下缓慢滴加入0.5mol/l氢氧化钠溶液，滴加结束后，65℃下回流反应，待反应完全后加入0.5mol/l hcl溶液调节ph＝5～6，用二氯甲烷萃取，收集二氯甲烷有机相，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液加入活性炭搅拌，过滤，滤液使用旋转蒸发仪减压蒸发溶剂，得到产物3；
产物3：(4)酰胺化连接:将产物3溶于dmf-ch2cl2混合溶剂中，加入催化剂和生物素-氨基，室温反应24h，反应后溶液用水稀释，加入二氯甲烷萃取，收集二氯甲烷有机相，有机相用饱和食盐水洗涤，再次收集有机相，使用旋转蒸发仪减压蒸发溶剂，即得为人参皂苷rh
4-生物素活性小分子探针；其中生物素-氨基为3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：高锰酸钾-丙酮溶液是高锰酸钾质量浓度为0.5％的丙酮溶液，添加量为1.1-1.2当量。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中产物2与氢氧化钠的摩尔比为1：86，步骤(4)中催化剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶、1-羟基苯并三唑和n,n-二异丙基乙胺，产物3与生物素-氨基的摩尔比为1:1-1.2。5.权利要求1所述人参皂苷rh4和人参皂苷rh
4-生物素活性小分子探针在制备神经保护药物中的应用。

技术总结

本发明公开了一种人参皂苷Rh

技术研发人员：

曲媛 钟炜 陈奕锦 潘俊

受保护的技术使用者：

云南省农业科学院农产品加工研究所

技术研发日：

2022.09.24

技术公布日：

2022/12/19