(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010589855.8
(22)申请日 2020.06.24
(83)生物保藏信息
CGMCC No.19951 2020.06.23
CGMCC No.19952 2020.06.23
(71)申请人 首都医科大学附属北京口腔医院
地址 100050 北京市东城区天坛西里4号
(72)发明人 杨秋波 陈园园
(74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限
公司 11227
代理人 潘颖
(51)Int.Cl.
C07K 16/12(2006.01)
C12N 5/20(2006.01)
G01N 33/569(2006.01)
G01N 33/577(2006.01) (54)发明名称
及试纸条、试剂盒
(57)摘要
本发明涉及生物医药领域，
特别涉及特异性识别牙龈卟啉单胞菌的单克隆抗体及试纸条、试
剂盒。本发明应用P.gingivalis和rHA2免疫小鼠
制备了识别P.gingivalis不同位点的单克隆抗
体，并从中筛选了配对抗体构建了特异性识别牙
龈卟啉单胞菌的双抗夹心ELISA体系。将筛选得
到的配对抗体用于制备简易的胶体金试纸条，简
易的胶体金试纸条可以快速识别109CFU/mL的
P.gingivalis。本发明的优点是简单、快速，可以
在2min内出结果，而且结果的判读不需要借助任
何仪器设备，
肉眼即可观测。权利要求书1页 说明书16页 附图8页CN 111995679 A 2020.11.27
C N 111995679
A
1.特异性识别牙龈卟啉单胞菌的单克隆抗体，其特征在于，由保藏编号为CGMCC No.19951或保藏编号为CGMCC No.19952的杂交瘤细胞株产生。
2.杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No.19951或CGMCC No.19952。
3.特异性识别牙龈卟啉单胞菌的单克隆抗体组合，其特征在于，包括保藏编号为CGMCC No.19951的杂交瘤细胞株的单克隆抗体和保藏编号为CGMCC No.19952的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。
4.如权利要求1所述的单克隆抗体或如权利要求3所述的单克隆抗体组合在制备检测牙龈卟啉单胞菌的检测工具中的应用。 5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述检测工具包括试剂盒、试纸条或芯片。
6.如权利要求1所述的单克隆抗体或如权利要求3所述的单克隆抗体组合在制备检测牙龈卟啉单胞菌相关疾病的检测工具中的应用；所述牙龈卟啉单胞菌相关疾病包括但不限于牙周炎、心血管疾病、糖尿病、阿尔兹海默症。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述检测工具包括试剂盒、试纸条或芯片。
8.试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的单克隆抗体或如权利要求3所述的单克隆抗体组合。
9.试纸条，其特征在于，包括如权利要求1所述的单克隆抗体或如权利要求3所述的单克隆抗体组合。
权 利 要 求 书1/1页CN 111995679 A
特异性识别牙龈卟啉单胞菌的单克隆抗体及试纸条、试剂盒
技术领域
[0001]本发明涉及生物医药领域，特别涉及特异性识别牙龈卟啉单胞菌的单克隆抗体及试纸条、试剂盒。
背景技术
[0002]牙龈卟啉单胞菌是牙周炎的主要致病菌之一，还与心血管、糖尿病和阿尔兹海默症等系统性疾病相关，所以对于牙龈卟啉单胞菌的检测有重要的意义。
[0003]当前牙龈卟啉单胞菌的检测主要依靠实时定量PCR，实时定量PCR敏感性和特异性均较好，但是实时定量PCR成本高，检测所需要的时间长，而且需要大型的实验设备以及熟练的技术人员进行操作，不能满足椅旁检测的需求，亟需能够快速、椅旁检测牙龈卟啉单胞菌的方法。
发明内容
[0004]有鉴于此，本发明提供了简单、快速、低成本、肉眼即可判读结果的牙龈卟啉单胞菌检测方法。
[0005]为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0006]本发明提供了特异性识别牙龈卟啉单胞菌的单克隆抗体，由保藏编号为CGMCC No.19951或保藏编号为CGMCCNo.19952的杂交瘤细胞株产生。
[0007]本发明还提供了杂交瘤细胞株，其保藏编号为CG M C C N o.19951或CG M C C No.19952。
[0008]在上述研究的基础上，本发明提供了特异性识别牙龈卟啉单胞菌的单克隆抗体组合，包括保藏编号为CGMCC No.19951的杂交瘤细胞株的单克隆抗体和保藏编号为CGMCC No.19952的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。
[0009]本发明还提供了所述的单克隆抗体或如权利要求3所述的单克隆抗体组合在制备检测牙龈卟啉单胞菌的检测工具中的应用。
[0010]在本发明的一些具体实施方案中，所述检测工具包括试剂盒、试纸条或芯片。[0011]更重要的是，本发明还提供了所述的单克隆抗体或所述的单克隆抗体组合在制备检测牙龈卟啉单胞菌相关疾病的检测工具中的应用；所述牙龈卟啉单胞菌相关疾病包括但不限于牙周炎、心血管疾病、糖尿病、阿尔兹海默症。
[0012]在本发明的一些具体实施方案中，所述检测工具包括试剂盒、试纸条或芯片。[0013]本发明还提供了试剂盒，包括所述的单克隆抗体或所述的单克隆抗体组合。[0014]本发明还提供了试纸条，包括
所述的单克隆抗体或所述的单克隆抗体组合。[0015]上述试纸条应用胶体金免疫层析技术，基于抗原抗体反应的检测，胶体金免疫层析基于双抗体夹心ELISA原理，需要两种识别同一抗原不同结合位点的单克隆抗体。首先，杂交瘤技术制备了识别牙龈卟啉单胞菌不同结合位点(单抗E10、E10-2识别P.gingivalis 不识别rHA2；单抗C10、F3、F3-2、G3和G3-2既识别P.gingivalis又识别rHA2)的单克隆抗体，
双抗体夹心ELISA的方法从制备的单克隆抗体中筛选出了最佳配对抗体，利用配对抗体制备了简易胶体金试纸条，制备的简易胶体金试纸条可以2min内检测109CFU/mL的牙龈卟啉单胞菌。
[0016]本发明的关键点在于应用P.g i n g i v a l i s和r H A2免疫小鼠制备了识别P.gingivalis不同位点的单克隆抗体，并从中筛选了配对抗体构建了特异性识别牙龈卟啉单胞菌的双抗夹心ELISA体系。现有应用的双抗体夹心ELISA原理检测P.gingivalis的试剂盒应用的间接双抗体夹心ELISA的方法，需要包被抗体和检测抗体来自不同物种，由单克隆抗体、多克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的抗检测抗体IgG组合；多克隆抗体识别多个抗原表位可能存在交叉反应，而且多克隆抗体数据有限，一旦耗尽，即使用相同的免疫原制备的抗血清也会与之前的抗血清存在差异。本发明中构建的直接双抗体夹ELISA应用的是结合P.gingivalis不同位点的单克隆抗体，其中一种作为包被抗体，检测抗体辣根过氧化物酶标记。单克隆抗体均一性和特异性均较好，而且可以持续再生，随着时间的推移，单克隆抗体的特性不会发生明显的改变。将筛选得到的配对抗体用于制备简易的胶体金试纸条，简易的胶体金试纸条可以
快速识别109CFU/mL的P.gingivalis。本发明的优点是简单、快速，可以在2min内出结果，而且结果的判读不需要借助任何仪器设备，肉眼即可观测。[0017]生物保藏说明
[0018]杂交瘤细胞株，E10，于2020年06月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.19951；
[0019]杂交瘤细胞株，G3，于2020年06月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.19952。
附图说明
[0020]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0021]图1示血清识别rHA2的效价；
[0022]图2示血清识别P.gingivalis的效价；
[0023]图3示单克隆抗体识别P.gingivalis的特异性；
[0024]图4示单克隆抗体识别P.gingivalis的敏感性；
[0025]图5示辣根过氧化物酶标记后单克隆抗体识别P.gingivalis的效价；
[0026]图6示双抗体夹心ELISA中HRPG3的最佳工作浓度；
[0027]图7示双抗体夹心ELISA包被抗体E10的最佳工作浓度；
[0028]图8示双抗体夹心ELISA识别P.gingivalis的特异性；
[0029]图9示双抗体夹心ELISA识别P.gingivalis的敏感性；
[0030]图10示胶体金试纸条识别P.gingivalis的敏感性；
[0031]图11示胶体金试纸条识别P.gingivalis的特异性；
[0032]图12示单克隆抗体识别P.gingivalis的效价；
[0033]图13示单克隆抗体识别rHA2的效价。
具体实施方式
[0034]本发明公开了一种特异性识别牙龈卟啉单胞菌的单克隆抗体及试纸条、试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0035]术语解释：
[0036]
[0037]ELISA相关溶液配制：
[0038]PBS：1袋PBS磷酸盐干粉加蒸馏水定容至2L。
[0039]PBST(含0.05％Tween-20的PBS)：量取2.5mLTween-20加入到500mLPBS中。[0040]封闭液(5％脱脂奶粉)：称取10g奶粉加入到200mLPBS中。
[0041]样品稀释液：5％脱脂奶粉：PBST＝1：15。
[0042]细胞培养用液配制：
[0043]不完全培养基配制
[0044]三蒸水溶解培养基干粉，在超净台中用0.22μm孔径的滤膜过滤除菌，pH调至7.2，4℃备用。
[0045]完全培养基
[0046]不完全培养基160mL，胎牛血清40mL。
[0047]HAT培养基
[0048]完全培养基98mL，HAT 2mL。
[0049]HT培养基
[0050]完全培养基99mL，HT 1mL。
[0051]细胞冻存液
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议