(10)申请公布号 (43)申请公布日 2015.02.11
C N 104342381
A (21)申请号 201310332510.4
(22)申请日 2013.08.01
CGMCC No.7587 2013.05.14
C12N 1/20(2006.01)
C12P 33/20(2006.01)
C12R 1/01(2006.01)
(71)申请人东北师范大学
地址130024 吉林省长春市南关区人民大街
5268号
(72)发明人周义发 高娟 王楠 王姣
孙成新 台桂花
(54)发明名称
(57)摘要
本发明涉及一种利用纤维菌
（Cellulosimicrobium sp.21）作为发酵菌种生
物转化人参总皂苷来制备稀有人参皂苷Rg2的方
法。本发明可以高效率制备高质量的稀有人参皂
苷Rg2。
(83)生物保藏信息
(51)Int.Cl.
权利要求书1页 说明书2页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书2页(10)申请公布号CN 104342381 A
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1.一种用于转化人参皂苷制备Rg2的细菌，其特征在于细菌菌株为纤维属，名为Cellulosimicrobium sp.21，于2013年5月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7587，该菌具有转化人参皂苷制备稀有人参皂苷Rg2的能力。
2.权利要求1所属的纤维属细菌CGMCC No.7587在制备人参皂苷Rg2中的应用。
3.采用权利要求1中所述的纤维属细菌CGMCC No.7587制备稀有人参皂苷Rg2的方法，其特征在于包含以下步骤：
a)发酵菌种的制备，取冻干管藏菌种，划线接种于LB 固体培养基上，在37℃的恒温培养箱中培养24小时，将活化后的菌种接于LB 液体培养基中，置于37℃，180转每分钟的水平摇床中培养12小时，得到种子液。
b)稀有皂苷Rg2的制备，将种子液和人参茎叶总皂苷一起加入到LB 液体培养基中，在37℃、180转每分钟的条件下培养24小时，硅胶柱层析法分离得到Rg2纯品。权 利 要 求 书CN 104342381 A
一种生物转化制备稀有人参皂苷Rg2的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及稀有人参皂苷Rg2的制备方法，主要涉及利用一种纤维菌（Cellulosimicrobium sp.21）作为发酵菌种生物转化人参茎叶总皂苷来制备稀有人参皂苷Rg2的方法，属于生化制药领域。
背景技术
[0002] 人参皂苷（ginsenoside）是人参中的主要活性成分之一，由皂苷元和糖基侧链组成，是一种固醇类化合物。依据糖苷基构架的不同，可将人参皂苷分为齐墩果烷型五环三萜类皂苷（oleanolic acid saponins）和达玛烷型四环三萜类皂苷（dammarane）两大类，其中后者又可分为原人参二醇型皂苷和原人参三醇型皂苷。人参皂苷具有很强的药理学活性，在抗肿瘤、抗疲劳、抗缺氧、抑制心肌坏死、延缓衰老等方面都有着重要作用。
[0003] 人参皂苷Rg2是一种稀有的人参皂苷，在人参中含量较低，但是却具极高的生理及药理学活性。Rg2对急性心源性休克有保护作用，具有抗休克、抗心衰、抗凝血、抗血栓等作用，主要表现在
强壮心肌，增强心肌收缩力，减慢心率，扩张血管，增加心输出量和提高冠脉流量，能快速改善心肌缺血和缺氧，具有明显的增强心功能作用。
[0004] 利用酸、碱水解等化学法和生物转化法可以将高含量的人参皂苷水解掉一个或几个侧链糖基得到高活性的人参皂苷。但是化学法产率低，转化出的副产物多，消耗大量有机溶剂，并且污染环境，而利用微生物的生物转化法则能够克服这些弊端，所以生物转化法被视为制备稀有人参皂苷最具有潜力的方法。
发明内容
[0005] 本发明提供了一株纤维菌（Cellulosimicrobium sp.21），并且利用该菌对人参茎叶总皂苷进行生物转化以达到高效、大量地制备稀有人参皂苷Rg2的目的。
[0006] 本发明中转化人参茎叶皂苷的发酵菌种为纤维属（Cellulosimicrobium sp.），是从长白山林地的人参种植土壤中筛选得到的野生菌种。本发明涉及的细菌Cellulosimicrobium sp.21，于2013年5月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7587。该菌具有如下性质：
[0007] 1、该菌菌落为圆形，在固体培养基表面，菌体初为半透明的白，之后转为淡黄，最后成为乳黄；
[0008] 2、该菌为革兰氏阳性菌；
[0009] 3、该菌为短胞杆菌，长杆状，培养后期逐渐变为短杆状，菌体大小为0.4-0.6微米× 1.6-3.0微米；
[0010] 4、菌体呈排列整齐的中等长度杆状，栅栏排列，尾部为钝端。
[0011] 本发明的制备方法如下：
[0012] 1、发酵菌种的制备
[0013] 取冻干管藏菌种，划线接种于LB固体培养基上，在37℃的恒温培养箱中培养24小
时。
[0014] 将活化后的菌种接于LB液体培养基中，置于37℃，180转每分钟的水平摇床中培养12小时，得到种子液。
[0015] 2、稀有皂苷Rg2的制备
[0016] 将步骤1的种子液和人参茎叶总皂苷一起加入到LB液体培养基中，在37℃、180转每分钟的条件
下培养24小时，转化后，人参茎叶总皂苷中的Re会转化成稀有人参皂苷Rg2，然后采用硅胶柱层析法分离得到Rg2纯品。
[0017] 发酵菌种的加入量为转化培养基的体积分数3%（v/v），人参茎叶总皂苷的加入量为6毫克每毫升。
[0018] 本发明通过微生物转化法将人参茎叶总皂苷中高含量的人参皂苷Re水解成稀有人参皂苷Rg2，该方法操作简便、产率高、成本低廉，可大规模生产制备稀有人参皂苷Rg2。
具体实施方式
[0019] 实施例1——发酵菌种制备
[0020] 取冻干管藏的纤维菌（Cellulosimicrobium sp.21），划线接种于LB固体培养基上，在37℃的恒温培养箱中培养1天以活化菌种。将活化后的菌种接于LB液体培养基中，置于37℃、180转每分钟的水平摇床中过夜培养，得到种子液。
[0021] 实施例2
[0022] 在15毫升LB培养基中加入终浓度为6毫克每毫升的人参茎叶总皂苷和3%的种子液，置于37℃水
平摇床中培养，转速为180转每分钟。培养12小时后取出，加入正丁醇，萃取人参皂苷，用TLC法进行检测，转化产物中人参皂苷Re没有完全被转化，有少量残留。[0023] 实施例3
[0024] 在15毫升LB培养基中加入终浓度为6毫克每毫升的人参茎叶总皂苷和体积分数3%的种子液，置于37℃水平摇床中培养，转速为180转每分钟。培养24小时后取出，加入正丁醇，萃取人参皂苷，用TLC法进行检测，转化产物中人参皂苷Re被转化完全，生成稀有人参皂苷Rg2以及少量人参皂苷Rh1和三醇型苷元。用硅胶柱层析法对转化产物进行分离，转化后的人参皂苷Rg2在转化产物中的比例达到42%。
[0025] 实施例4
[0026] 在200毫升LB培养基中加入终浓度为6毫克每毫升的人参茎叶总皂苷和3%的种子液，置于37℃水平摇床中培养，转速为180转每分钟。培养24小时后取出，加入正丁醇，萃取人参皂苷，用TLC法进行检测，转化产物中人参皂苷Re没有完全被转化，有少量残留。[0027] 实施例5
[0028] 在200毫升LB培养基中加入终浓度为6毫克每毫升的人参茎叶总皂苷和3%的种子液，置于37℃水平摇床中培养，转速为180转每分钟。培养36小时后取出，加入正丁醇，萃取人参皂苷，用TLC法进行检测，转化产物中人参皂苷Re被转化完全，生成稀有人参皂苷Rg2以及少量人参皂苷Rh1和三醇型苷元。
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