一种胎盘中血小板裂解物的制备方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种胎盘中血小板裂解物的制备方法。

背景技术：

2.目前，血小板裂解物的制备，主要有以下技术要点尚待解决：(1)血小板来源。当前研究主要采用少数志愿者外周血分离浓缩血小板或单采血小板制备，无法形成规模，满足需求。因此也带来pl均一性的问题。(2)目前为止，血小板裂解物相关临床研究已有近200项，但由于缺乏血小板裂解物制备及产品的严格标准，制备方法不一致，导致研究结果之间差异巨大，缺乏可比性，重复性也较差。(3)现有技术中采用的制备血小板裂解物的方法中血小板的裂解并不完全，从而使得相关因子并未完全释放。
3.胎盘中富含血小板，此前多以医疗废物的形式处理，从胎盘中提取血小板，制备血小板裂解物可以极大的增加血小板的来源，基于此，本发明提供一种胎盘中血小板裂解物的制备方法。

技术实现要素：

4.针对现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种胎盘中血小板裂解物的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
5.本发明解决技术问题采用如下技术方案：
6.本发明提供了一种胎盘中血小板裂解物的制备方法，包括以下步骤：
7.s1、胎盘保护液的配置；
8.s2、将新鲜的胎盘组织装入无菌采样袋中，倒入配置好的胎盘保护液，密封好后轻轻晃动无菌采样袋，使胎盘保护液与胎盘组织充分接触；
9.s3、冷链运输至实验室；
10.s4、在生物安全柜中打开无菌采样袋，取出胎盘，放到医用托盘中备用；
11.s5、将胎盘保护液收集到50ml离心管中，800-1200rpm/min离心10-15min；
12.s6、将上清收集到新的离心管中，1500-2000rpm/min离心10min，去上清；
13.s7、用无菌手术剪将胎盘小叶剪下，并放入新的托盘中，充分剪碎；
14.s8、300ml生理盐水浸润剪碎的组织后，200目滤网过滤；
15.s9、收集滤液到离心管中重复s5、s6步骤；
16.s10、将s6、s9所得的沉淀合并到同一50ml离心管中，将多个胎盘所获取的富集的血小板合并至同一50ml离心管中；
17.s11、3000-3500rpm/min、10-15min去除细胞碎片；
18.s12、4500-5000rpm/min离心10-15min进一步去除细胞碎片；
19.s13、过滤进一步去除细胞碎片，并除菌。
20.优选地，所述胎盘保护液的配置方法为：取300ml生理盐水加入200iu/ml肝素钠和3ml双抗。
21.优选地，所述冷链运输的温度为2-8℃。
22.优选地，所述冷链运输的温度为5℃。
23.优选地，所述s6、s9所得的沉淀为富集的血小板。
24.优选地，所述s10、s11步骤间还采用的步骤有：
25.血球计数板计血小板个数；
26.反复冻融裂解血小板；
27.血球计数板检查血小板残留量。
28.优选地，所述s12中以5000rpm/min离心15min进一步去除细胞碎片。
29.优选地，所述s13中采用0.22μm滤膜过滤。
30.与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
31.本发明s5中离心后可出现明显的分层现象，下层为红细胞层，上层中包含血小板，收集的上清时可向红细胞层多吸取2-3mm；s6中离心后可见明显分层，下层为血小板富集物，上层为血浆及生理盐水混合物，去上清时可留2-3mm上清；s12中反复冻融的条件为-197℃(液氮)大于12个小时，37℃水浴锅迅速融解，冻融次数不低于6次；s13血球计数板计得血小板裂解率＞95％；s16显微镜下400x未发现细胞碎片及其他杂质，且无菌检测，内毒素检测均为阴性。
具体实施方式
32.下面结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
33.本实施例的一种胎盘中血小板裂解物的制备方法，包括以下步骤：
34.s1、胎盘保护液的配置；
35.s2、将新鲜的胎盘组织装入无菌采样袋中，倒入配置好的胎盘保护液，密封好后轻轻晃动无菌采样袋，使胎盘保护液与胎盘组织充分接触；
36.s3、冷链运输至实验室；
37.s4、在生物安全柜中打开无菌采样袋，取出胎盘，放到医用托盘中备用；
38.s5、将胎盘保护液收集到50ml离心管中，800-1200rpm/min离心10-15min；
39.s6、将上清收集到新的离心管中，1500-2000rpm/min离心10min，去上清；
40.s7、用无菌手术剪将胎盘小叶剪下，并放入新的托盘中，充分剪碎；
41.s8、300ml生理盐水浸润剪碎的组织后，200目滤网过滤；
42.s9、收集滤液到离心管中重复s5、s6步骤；
43.s10、将s6、s9所得的沉淀合并到同一50ml离心管中，将多个胎盘所获取的富集的血小板合并至同一50ml离心管中；
44.s11、3000-3500rpm/min、10-15min去除细胞碎片；
45.s12、4500-5000rpm/min离心10-15min进一步去除细胞碎片；
46.s13、过滤进一步去除细胞碎片，并除菌。
47.本实施例的胎盘保护液的配置方法为：取300ml生理盐水加入200iu/ml肝素钠和
3ml双抗。
48.本实施例的运输的温度为2-8℃。
49.本实施例的冷链运输的温度为5℃。
50.本实施例的s6、s9所得的沉淀为富集的血小板。
51.本实施例的s10、s11步骤间还采用的步骤有：
52.血球计数板计血小板个数；
53.反复冻融裂解血小板；
54.血球计数板检查血小板残留量。
55.本实施例的s12中以5000rpm/min离心15min进一步去除细胞碎片。
56.本实施例的s13中采用0.22μm滤膜过滤。
57.实施例1.
58.本实施例的一种胎盘中血小板裂解物的制备方法，包括以下步骤：
59.s1、胎盘保护液的配置；
60.s2、将新鲜的胎盘组织装入无菌采样袋中，倒入配置好的胎盘保护液，密封好后轻轻晃动无菌采样袋，使胎盘保护液与胎盘组织充分接触；
61.s3、冷链运输至实验室；
62.s4、在生物安全柜中打开无菌采样袋，取出胎盘，放到医用托盘中备用；
63.s5、将胎盘保护液收集到50ml离心管中，800rpm/min离心10min；
64.s6、将上清收集到新的离心管中，1500rpm/min离心10min，去上清；
65.s7、用无菌手术剪将胎盘小叶剪下，并放入新的托盘中，充分剪碎；
66.s8、300ml生理盐水浸润剪碎的组织后，200目滤网过滤；
67.s9、收集滤液到离心管中重复s5、s6步骤；
68.s10、将s6、s9所得的沉淀合并到同一50ml离心管中，将多个胎盘所获取的富集的血小板合并至同一50ml离心管中；
69.s11、3000rpm/min、10min去除细胞碎片；
70.s12、4500rpm/min离心10min进一步去除细胞碎片；
71.s13、过滤进一步去除细胞碎片，并除菌。
72.本实施例的胎盘保护液的配置方法为：取300ml生理盐水加入200iu/ml肝素钠和3ml双抗。
73.本实施例的运输的温度为2℃。
74.本实施例的冷链运输的温度为5℃。
75.本实施例的s6、s9所得的沉淀为富集的血小板。
76.本实施例的s10、s11步骤间还采用的步骤有：
77.血球计数板计血小板个数；
78.反复冻融裂解血小板；
79.血球计数板检查血小板残留量。
80.本实施例的s12中以5000rpm/min离心15min进一步去除细胞碎片。
81.本实施例的s13中采用0.22μm滤膜过滤。
82.实施例2.
83.本实施例的一种胎盘中血小板裂解物的制备方法，包括以下步骤：
84.s1、胎盘保护液的配置；
85.s2、将新鲜的胎盘组织装入无菌采样袋中，倒入配置好的胎盘保护液，密封好后轻轻晃动无菌采样袋，使胎盘保护液与胎盘组织充分接触；
86.s3、冷链运输至实验室；
87.s4、在生物安全柜中打开无菌采样袋，取出胎盘，放到医用托盘中备用；
88.s5、将胎盘保护液收集到50ml离心管中，1200rpm/min离心15min；
89.s6、将上清收集到新的离心管中，2000rpm/min离心10min，去上清；
90.s7、用无菌手术剪将胎盘小叶剪下，并放入新的托盘中，充分剪碎；
91.s8、300ml生理盐水浸润剪碎的组织后，200目滤网过滤；
92.s9、收集滤液到离心管中重复s5、s6步骤；
93.s10、将s6、s9所得的沉淀合并到同一50ml离心管中，将多个胎盘所获取的富集的血小板合并至同一50ml离心管中；
94.s11、3500rpm/min、15min去除细胞碎片；
95.s12、5000rpm/min离心15min进一步去除细胞碎片；
96.s13、过滤进一步去除细胞碎片，并除菌。
97.本实施例的胎盘保护液的配置方法为：取300ml生理盐水加入200iu/ml肝素钠和3ml双抗。
98.本实施例的运输的温度为8℃。
99.本实施例的s6、s9所得的沉淀为富集的血小板。
100.本实施例的s10、s11步骤间还采用的步骤有：
101.血球计数板计血小板个数；
102.反复冻融裂解血小板；
103.血球计数板检查血小板残留量。
104.本实施例的s12中以5000rpm/min离心15min进一步去除细胞碎片。
105.本实施例的s13中采用0.22μm滤膜过滤。
106.实施例3.
107.本实施例的一种胎盘中血小板裂解物的制备方法，包括以下步骤：
108.s1、胎盘保护液的配置；
109.s2、将新鲜的胎盘组织装入无菌采样袋中，倒入配置好的胎盘保护液，密封好后轻轻晃动无菌采样袋，使胎盘保护液与胎盘组织充分接触；
110.s3、冷链运输至实验室；
111.s4、在生物安全柜中打开无菌采样袋，取出胎盘，放到医用托盘中备用；
112.s5、将胎盘保护液收集到50ml离心管中，1000rpm/min离心12.5min；
113.s6、将上清收集到新的离心管中，1850rpm/min离心10min，去上清；
114.s7、用无菌手术剪将胎盘小叶剪下，并放入新的托盘中，充分剪碎；
115.s8、300ml生理盐水浸润剪碎的组织后，200目滤网过滤；
116.s9、收集滤液到离心管中重复s5、s6步骤；
117.s10、将s6、s9所得的沉淀合并到同一50ml离心管中，将多个胎盘所获取的富集的
血小板合并至同一50ml离心管中；
118.s11、3250rpm/min、10-15min去除细胞碎片；
119.s12、4750rpm/min离心12.5min进一步去除细胞碎片；
120.s13、过滤进一步去除细胞碎片，并除菌。
121.本实施例的胎盘保护液的配置方法为：取300ml生理盐水加入200iu/ml肝素钠和3ml双抗。
122.本实施例的运输的温度为2-8℃。
123.本实施例的冷链运输的温度为5℃。
124.本实施例的s6、s9所得的沉淀为富集的血小板。
125.本实施例的s10、s11步骤间还采用的步骤有：
126.血球计数板计血小板个数；
127.反复冻融裂解血小板；
128.血球计数板检查血小板残留量。
129.本实施例的s12中以5000rpm/min离心15min进一步去除细胞碎片。
130.本实施例的s13中采用0.22μm滤膜过滤。
131.实施例4.
132.本实施例的一种胎盘中血小板裂解物的制备方法，包括以下步骤：
133.s1、胎盘保护液的配置；
134.s2、将新鲜的胎盘组织装入无菌采样袋中，倒入配置好的胎盘保护液，密封好后轻轻晃动无菌采样袋，使胎盘保护液与胎盘组织充分接触；
135.s3、冷链运输至实验室；
136.s4、在生物安全柜中打开无菌采样袋，取出胎盘，放到医用托盘中备用；
137.s5、将胎盘保护液收集到50ml离心管中，900rpm/min离心1
·
in；
138.s6、将上清收集到新的离心管中，1600rpm/min离心10min，去上清；
139.s7、用无菌手术剪将胎盘小叶剪下，并放入新的托盘中，充分剪碎；
140.s8、300ml生理盐水浸润剪碎的组织后，200目滤网过滤；
141.s9、收集滤液到离心管中重复s5、s6步骤；
142.s10、将s6、s9所得的沉淀合并到同一50ml离心管中，将多个胎盘所获取的富集的血小板合并至同一50ml离心管中；
143.s11、3250rpm/min、12.5min去除细胞碎片；
144.s12、4750rpm/min离心12.5min进一步去除细胞碎片；
145.s13、过滤进一步去除细胞碎片，并除菌。
146.本实施例的胎盘保护液的配置方法为：取300ml生理盐水加入200iu/ml肝素钠和3ml双抗。
147.本实施例的运输的温度为5℃。
148.本实施例的s6、s9所得的沉淀为富集的血小板。
149.本实施例的s10、s11步骤间还采用的步骤有：
150.血球计数板计血小板个数；
151.反复冻融裂解血小板；
152.血球计数板检查血小板残留量。
153.本实施例的s12中以5000rpm/min离心15min进一步去除细胞碎片。
154.本实施例的s13中采用0.22μm滤膜过滤。
155.实施例5.
156.本实施例的一种胎盘中血小板裂解物的制备方法，包括以下步骤：
157.s1、胎盘保护液的配置；
158.s2、将新鲜的胎盘组织装入无菌采样袋中，倒入配置好的胎盘保护液，密封好后轻轻晃动无菌采样袋，使胎盘保护液与胎盘组织充分接触；
159.s3、冷链运输至实验室；
160.s4、在生物安全柜中打开无菌采样袋，取出胎盘，放到医用托盘中备用；
161.s5、将胎盘保护液收集到50ml离心管中，900rpm/min离心12min；
162.s6、将上清收集到新的离心管中，1600rpm/min离心10min，去上清；
163.s7、用无菌手术剪将胎盘小叶剪下，并放入新的托盘中，充分剪碎；
164.s8、300ml生理盐水浸润剪碎的组织后，200目滤网过滤；
165.s9、收集滤液到离心管中重复s5、s6步骤；
166.s10、将s6、s9所得的沉淀合并到同一50ml离心管中，将多个胎盘所获取的富集的血小板合并至同一50ml离心管中；
167.s11、3200rpm/min、12min去除细胞碎片；
168.s12、4600rpm/min离心12min进一步去除细胞碎片；
169.s13、过滤进一步去除细胞碎片，并除菌。
170.本实施例的胎盘保护液的配置方法为：取300ml生理盐水加入200iu/ml肝素钠和3ml双抗。
171.本实施例的运输的温度为3℃。
172.本实施例的s6、s9所得的沉淀为富集的血小板。
173.本实施例的s10、s11步骤间还采用的步骤有：
174.血球计数板计血小板个数；
175.反复冻融裂解血小板；
176.血球计数板检查血小板残留量。
177.本实施例的s12中以5000rpm/min离心15min进一步去除细胞碎片。
178.本实施例的s13中采用0.22μm滤膜过滤。
179.对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
180.此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

技术特征：

1.一种胎盘中血小板裂解物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、胎盘保护液的配置；s2、将新鲜的胎盘组织装入无菌采样袋中，倒入配置好的胎盘保护液，密封好后轻轻晃动无菌采样袋，使胎盘保护液与胎盘组织充分接触；s3、冷链运输至实验室；s4、在生物安全柜中打开无菌采样袋，取出胎盘，放到医用托盘中备用；s5、将胎盘保护液收集到50ml离心管中，800-1200rpm/min离心10-15min；s6、将上清收集到新的离心管中，1500-2000rpm/min离心10min，去上清；s7、用无菌手术剪将胎盘小叶剪下，并放入新的托盘中，充分剪碎；s8、300ml生理盐水浸润剪碎的组织后，200目滤网过滤；s9、收集滤液到离心管中重复s5、s6步骤；s10、将s6、s9所得的沉淀合并到同一50ml离心管中，将多个胎盘所获取的富集的血小板合并至同一50ml离心管中；s11、3000-3500rpm/min、10-15min去除细胞碎片；s12、4500-5000rpm/min离心10-15min进一步去除细胞碎片；s13、过滤进一步去除细胞碎片，并除菌。2.根据权利要求1所述的一种胎盘中血小板裂解物的制备方法，其特征在于，所述胎盘保护液的配置方法为：取300ml生理盐水加入200iu/ml肝素钠和3ml双抗。3.根据权利要求1所述的一种胎盘中血小板裂解物的制备方法，其特征在于，所述冷链运输的温度为2-8℃。4.根据权利要求3所述的一种胎盘中血小板裂解物的制备方法，其特征在于，所述冷链运输的温度为5℃。5.根据权利要求1所述的一种胎盘中血小板裂解物的制备方法，其特征在于，所述s6、s9所得的沉淀为富集的血小板。6.根据权利要求1所述的一种胎盘中血小板裂解物的制备方法，其特征在于，所述s10、s11步骤间还采用的步骤有：血球计数板计血小板个数；反复冻融裂解血小板；血球计数板检查血小板残留量。7.根据权利要求1所述的一种胎盘中血小板裂解物的制备方法，其特征在于，所述s12中以5000rpm/min离心15min进一步去除细胞碎片。8.根据权利要求1所述的一种胎盘中血小板裂解物的制备方法，其特征在于，所述s13中采用0.22μm滤膜过滤。

技术总结

本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种胎盘中血小板裂解物的制备方法，涉及生物技术领域，包括以下步骤：胎盘组织的处理；胎盘血小板富集血浆的制备；胎盘血小板裂解；细胞碎片的去除；微生物去除。还提供了胎盘采集过程中所用的胎盘保护液的配置。上述制备方法操作简单、成本较低且可控性强。成本较低且可控性强。

技术研发人员：

朱锋林 王苗苗 李纬国

受保护的技术使用者：

上海君益禾生物医学科技有限公司

技术研发日：

2022.10.18

技术公布日：

2022/12/1