一种肉牛脂肪酸组分候选标记多组学筛选方法及其应用

1.本发明涉及肉牛育种技术领域，具体涉及一种肉牛脂肪酸组分候选标记多组学筛选方法及其应用。

背景技术：

2.牛肉富含蛋白质、铁、锌、维生素b和必需的多不饱和脂肪酸，是人类高品质营养的来源。随着现代生活水平的提高和健康消费意识的增强，我国的消费者对牛肉的数量和品质的需求也呈逐年递增趋势。肉质性状是一个复杂经济性状，大量基因参与调控肉质性状的形成过程，但目前牛肉品质遗传标记和相关功能基因的信息非常有限，严重阻碍我国肉牛优良品种选育和新品种培育进程。
3.脂肪酸组分作为肉质的一类重要性状，影响着牛肉风味、多汁性、嫩度和口感。虽然已有研究开展了脂肪酸候选位点或基因的鉴定，但是研究方法较单一，多数是基于全基因组关联分析(gwas)策略，样本遗传背景较复杂，对于基因组层面筛选到的遗传标记或者候选基因，大多数位于非编码区域或者标记位点的功能尚不清楚。因此，针对不同的肉牛品种，开展多组学遗传标记的筛选，为优化芯片设计提供重要技术支撑，对肉牛的生产和育种都具有重要理论意义和经济价值。

技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种肉牛脂肪酸组分候选标记多组学筛选方法，能够对鉴定到的肉牛脂肪酸组分候选标记功能进行分析，为优化芯片设计提供重要技术支撑。
5.为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
6.本发明提供了一种肉牛脂肪酸组分候选标记多组学筛选方法，所述方法包括如下步骤：
7.测定样本脂肪酸含量并进行转录组测序，经高低组差异分析获得脂肪酸组分的deg基因，筛选差异区域及标记；
8.取高低组样本进行wgbs测序，鉴定得到差异甲基化胞嘧啶dmcs和差异甲基化区域dmrs；
9.采用atac测序获得高低组样本中的差异开放染质区域docrs，得到差异染质可及性标记；然后对各区域进行置换检验，从具有显著性候选区域中获得所述脂肪酸组分候选标记。
10.优选的，所述样本为肉牛背最长肌组织。
11.优选的，所述方法还包括脂肪酸组分相关候选qtl汇集。
12.更优选的，所述脂肪酸组分相关候选qtl汇集包括如下三种策略：华西牛脂肪酸组分上的研究结果，pubmed数据库检索或animal qtl公共数据库。
13.优选的，根据样本中脂肪酸含量的高低，选择极端差异个体进行转录组测序。
14.优选的，所述差异甲基化胞嘧啶dmcs为胞嘧啶发生甲基化，所述胞嘧啶发生甲基化mc的甲基化水平ml由下述公式计算得到：
[0015][0016]
所述公式为甲基化read counts比上所有read counts的总和。
[0017]
优选的，所述差异甲基化区域dmrs为：甲基化差值》30％和q值《0.05，窗口大小等于500bp，步长大小等于500bp。
[0018]
优选的，所述wgbs测序和atac测序平台为illumina hiseq x10。
[0019]
优选的，对上述的qtl、dmcs、dmrs和docrs候选区域进行置换检验。
[0020]
本发明还提供了上述的方法在肉牛生产或育种中的应用。
[0021]
本发明提供了一种肉牛脂肪酸组分候选标记多组学筛选方法，基于转录组，表观组等多组学数据对鉴定到的遗传标记或者候选基因进行功能上的进一步解析，避免了全基因组关联分析(gwas)策略导致的基因组层面筛选到的遗传标记或者候选基因多数位于非编码区域或者标记位点的功能尚不清楚的问题，为优化芯片设计提供重要技术支撑，对肉牛的生产和育种都具有重要理论意义和经济价值。
附图说明
[0022]
图1为一种肉牛脂肪酸候选标记多组学筛选研究方法的流程图。
[0023]
图2为一种肉牛脂肪酸候选标记多组学筛选研究方法中主因子分析；其中，a代表陡坡图，横坐标为主成分，纵坐标为特征值，b代表已解释方差，虚线为累积方差，直线为方差比例。
[0024]
图3为一种肉牛脂肪酸候选标记多组学筛选研究方法中高低甲基化在染体上的百分比；其中，a代表高甲基化和低甲基化位点在染体上的百分比，b代表高甲基化和低甲基化区域在染体上的百分比。
[0025]
图4为一种肉牛脂肪酸候选标记多组学筛选研究方法中qtl与dmc位点富集分析。
[0026]
图5为一种肉牛脂肪酸候选标记多组学筛选研究方法中qtl与dmr位点富集分析。
[0027]
图6为实施例2利用本发明所述筛选方法进行基因组预测的准确性结果。
具体实施方式
[0028]
本发明提供了一种肉牛脂肪酸组分候选标记多组学筛选方法，所述方法包括如下步骤：
[0029]
测定样本脂肪酸含量并进行转录组测序，经高低组差异分析获得脂肪酸组分的deg基因，筛选差异区域及标记；
[0030]
取高低组样本进行wgbs测序，鉴定得到差异甲基化胞嘧啶dmcs和差异甲基化区域dmrs；
[0031]
采用atac测序获得高低组样本中的差异开放染质区域docrs，得到差异染质可及性标记；然后对各区域进行置换检验，从具有显著性候选区域中获得所述脂肪酸组分候选标记。
[0032]
本发明中，所述样本优选为肉牛背最长肌组织；本发明对所述肉牛的品种并没有
特殊限定，在本发明的具体实施例中，所述肉牛优选为华西牛。
[0033]
本发明中，所述方法还包括脂肪酸组分相关候选qtl汇集；所述脂肪酸组分相关候选qtl汇集优选的包括如下三种策略：华西牛脂肪酸组分上的研究结果，pubmed数据库检索或animal qtl公共数据库。本发明中，所述脂肪酸组分相关候选qtl汇集汇总和整理了脂肪酸组分变异位点和候选基因，为肉牛脂肪酸性状的改良提供了变异信息库。
[0034]
本发明中，根据样本中脂肪酸含量的高低，选择极端差异个体进行转录组测序。本发明中，所述脂肪酸含量的测定优选的按照gb/t 5009.168-2016标准执行。本发明中，所述转录组测序获得的数据优选的进行质控；所述质控优选的包括ploy-n的reads、修剪接头和低质量的reads。本发明中，所述转录组测序获得的数据经质控后优选的用fpkm指标估计基因的表达水平，然后进行高低组差异分析；所述高低组差异分析中，优选的采用r包deseq2(v.1.32.0)鉴定差异候选标记。
[0035]
本发明中，所述差异甲基化胞嘧啶dmcs为胞嘧啶发生甲基化，所述胞嘧啶发生甲基化mc的甲基化水平ml由下述公式计算得到：
[0036][0037]
其中，所述公式为甲基化read counts比上所有read counts的总和。本发明中，所述差异甲基化区域dmrs为：甲基化差值》30％和q值《0.05，窗口大小等于500bp，步长大小等于500bp。本发明中，所述胞嘧啶发生甲基化的位点mc优选的由bismark(v.0.23.0)软件获得；所述dmcs和dmrs的鉴定优选的由r包methylkit(v.1.18.0)获得。
[0038]
本发明中，所述wgbs测序和atac测序平台优选为illumina hiseq x10。本发明中，利用genrich(v.0.6)软件获得染质可及性区域，利用diffbind(v.3.2.7)鉴别高低组间的差异开放染质区域docrs，从而得到差异染质可及性标记。
[0039]
本发明中，通过基因组、转录组、dna甲基化修饰和染质可及性测序技术鉴定到脂肪酸组分候选基因，然后对上述的qtl、dmcs、dmrs和docrs候选区域进行置换检验；所述置换检验是为了检测不同区域之间相关的显著性。
[0040]
本发明还提供了上述的方法在肉牛生产或育种中的应用。
[0041]
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0042]
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
[0043]
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0044]
实施例1
[0045]
一种肉牛脂肪酸候选标记多组学筛选方法，具体步骤如下：
[0046]
1.步骤一：脂肪酸组分相关候选qtl汇集：主要从三方面策略去挖掘相关信息，首先，收集在华西牛脂肪酸性状方面已发表的相关研究。其次，用“cattle”“fatty acid”“gwas”关键词搜索的方法在pubmed数据库进行检索，获取并汇总相关变异位点信息。最后，基于animal qtl公共数据库中的cattle qtl数据库，下载ars-ucd1.2基因组版本的qtl数据文件，按照性状进行分类汇总，收集脂肪酸性状相关候选qtl信息，共鉴定到脂肪酸组分候选qtl 643个。
[0047]
2.步骤二：在脂肪酸组分检测上，首先对于冷冻的120头背最长肌肉样放在4℃条
件下解冻48h，然后，大约10克新鲜样品被搅碎，放置在冻干机进行干燥。肉类脂肪酸组分的测定按照gb/t 5009.168-2016标准执行，120头华西牛背最长肌样本脂肪酸性状的描述性统计如表1所示。
[0048]
表1 120头华西牛背最长肌样本脂肪酸性状的描述性统计
[0049]
[0050][0051][0052]
对120头肉牛背最长肌组织进行转录组测序，所得的转录组数据分析用fastp软件
(v.0.18.0)，用fpkm指标估计基因的表达水平。然后，从120头华西牛个体中采集10个背最长肌(12-13肋骨)样本，它们具有相同的屠宰批次和遗传背景。采用sas软件(v.9.4)进行主因子分析评价10个样品的脂肪酸组分，结果如图2所示。
[0053]
依据评价结果将10个样本分选为高组(n＝5)和低组(n＝5)进行下游分析，采用r包deseq2(v.1.32.0)进行差异表达基因鉴定。结果筛选到1,044个差异表达基因，其中上调基因320个，下调基因724个，同时也鉴定到34个参与脂肪酸过程和脂质过程的候选基因区域。
[0054]
3.步骤三：收集与步骤二中脂肪酸组分差异分析相同的10个背最长肌样本进行wgbs测序，采用fastp(v.0.18.0)软件对wgbs测序所得原始数据进行质控，bismark(v.0.23.0)鉴定dna甲基化位点，methylkit(v.1.18.0)鉴定差异甲基化胞嘧啶(dmcs)和差异甲基化区域(dmrs)。最后，使用david(v.6.8)数据库对dmcs和dmrs的基因进行功能注释和通路富集。
[0055]
结果：组间共鉴定出23,763个dmcs(高甲基化12,660个，低甲基化11,104个)和3,411个dmrs(高甲基化1,842个，低甲基化1,575个)。计算每条染体上高甲基化和低甲基化dmc和dmr的百分比和数量分布，结果如图3。此外，还鉴定到115个dmc候选位点和26个dmr候选区域与脂肪酸过程和脂质过程相关。
[0056]
4.步骤四：收集与步骤二中脂肪酸组分差异分析相同的10个背最长肌样本进行atac测序，采用fastp(v.0.18.0)软件对atac测序所得原始数据进行质控，genrich(v.0.6)检测肌肉样本中的peaks，diffbind(v.3.2.7)鉴定差异开放染质区域(docrs)。
[0057]
结果：组间鉴定出2,750个docrs(1,479个上调，1,271个下调)。根据差异开放染质区域的基因注释，有1,147个docrs作为潜在区域。此外，本研究还鉴定了33个与脂肪酸过程和脂质过程相关的候选区域。
[0058]
5.步骤五：在华西牛脂肪酸候选基因遗传调控解析研究上，以背最长肌组织为样本，基于全基因组关联分析、rna-seq、wgbs、atac-seq测序技术，鉴定和汇总脂肪酸组分候选区域；
[0059]
在不同功能基因组区域相关性方面，采用regioner(v.1.24.0)评估不同基因组区域之间的富集程度，不同策略鉴定到的基因组区域包括qtl、dmc、dmr、docr候选区域，并采用置换检验(1000 permutation test)检测显著性，结果如图4-图5。
[0060]
图4和图5显示了qtl与其它功能区域的富集分析，显示qtl集分别在dmc(p《0.028,z-score＝2.148)、dmr(p《0.025,z-score＝2.104)区域集中显着富集。
[0061]
然后，基于不同组学得到的候选标记(qtl区域与不同组学筛选的区域有重叠)即可用于指导专门化芯片设计。
[0062]
实施例2
[0063]
基于qtl、dmc、dmr、docr候选区域，采用plink(v.1.07)软件从770k芯片中保留区域内的snp位点，作为实验组。同时，随机选择相同数目的snp作为对照组，共抽取5组。然后，采用gcta(v.1.94)软件构建g矩阵，基于基因组最佳线性无偏预测模型(genomic best linear unbiased prediction，gblup)对目标性状进行基因组预测，最后，采用准确性(r)指标作为基因组预测准确性的评价指标。本实施例采用5倍交叉验证，重复10次的方式进行准确性评估，最终将50次交叉验证的结果取平均数作为最终的准确性，结果如图6所示。本
实施例选择c16:0、c18:0和c18:1n9c作为目标性状。
[0064]
结果：多组学分析得到1365个候选基因组区域，包含46663个snp。然后，基因组预测结果显示，实验组中c16:0、c18:0和c18:1n9c的准确性分别为0.147、0.292和0.254，对照组的准确性分别为0.12、0.245和0.197，准确性分别提升0.027、0.047和0.057。
[0065]
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

技术特征：

1.一种肉牛脂肪酸组分候选标记多组学筛选方法及其应用，其特征在于，所述方法包括如下步骤：测定样本脂肪酸含量并进行转录组测序，经高低组差异分析获得脂肪酸组分的deg基因，筛选差异区域及标记；取高低组样本进行wgbs测序，鉴定得到差异甲基化胞嘧啶dmcs和差异甲基化区域dmrs；采用atac测序获得高低组样本中的差异开放染质区域docrs，得到差异染质可及性标记；然后对各区域进行置换检验，从具有显著性候选区域中获得所述脂肪酸组分候选标记。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样本为肉牛背最长肌组织。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括脂肪酸组分相关候选qtl汇集。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述脂肪酸组分相关候选qtl汇集包括如下三种策略：华西牛脂肪酸组分上的研究结果，pubmed数据库检索或animal qtl公共数据库。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，根据样本中脂肪酸含量的高低，选择极端差异个体进行转录组测序。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述差异甲基化胞嘧啶dmcs为胞嘧啶发生甲基化，所述胞嘧啶发生甲基化mc的甲基化水平ml由下述公式计算得到：所述公式为甲基化read counts比上所有read counts的总和。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述差异甲基化区域dmrs为：甲基化差值>30％和q值<0.05，窗口大小等于500bp，步长大小等于500bp。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述wgbs测序和atac测序平台为illumina hiseqx10。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对权利要求3所述的qtl、权利要求1所述的dmcs、dmrs和docrs候选区域进行置换检验。10.权利要求1-9任意一项所述的方法在肉牛生产或育种中的应用。

技术总结

本发明提供了一种肉牛脂肪酸组分候选标记多组学筛选方法及其应用，涉及肉牛育种技术领域。本发明提供了一种肉牛脂肪酸组分候选标记多组学筛选方法，基于转录组，表观组等多组学数据对鉴定到的遗传标记或者候选基因进行功能上的进一步解析，避免了全基因组关联分析GWAS策略导致的基因组层面筛选到的遗传标记或者候选基因多数位于非编码区域或者标记位点的功能尚不清楚的问题，为优化芯片设计提供重要技术支撑，对肉牛的生产和育种都具有重要理论意义和经济价值。理论意义和经济价值。理论意义和经济价值。