乳酸钙在提高枯草芽孢杆菌合成杆菌霉素D的应用和乳酸钙发酵培养基及方法

乳酸钙在提高枯草芽孢杆菌合成杆菌霉素d的应用和乳酸钙发酵培养基及方法
技术领域
1.本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及乳酸钙在提高枯草芽孢杆菌合成杆菌霉素d的应用和乳酸钙发酵培养基及方法。

背景技术：

2.杆菌霉素d是由枯草芽孢杆菌中非核糖体肽合酶催化合成的一种属于iturin家族的抗菌脂肽。受潮的粮食很容易因霉变而产生真菌毒素(如黄曲霉毒素和赭曲霉毒素等)，而杆菌霉素d对农业病原真菌(如黄曲霉和赭曲霉等)具有很强的抑制作用。因此，杆菌霉素d在保障粮食和食品安全以及防治真菌污染等方面都具有重要应用前景。但是，枯草芽孢杆菌在常规培养基进行发酵培养时合成杆菌霉素d的能力有限，杆菌霉素d的产量低，限制了杆菌霉素d的大规模工业化应用。现有技术中多应用以酵母膏，l-谷氨酸和葡萄糖组成的培养基生产杆菌毒素d，但是杆菌霉素d的产量低。中国专利cn110016490a一种用于生产杆菌霉素d的发酵培养基和生产杆菌霉素d的方法公开了利用玉米秸秆纤维素酶酶解上清液、酵母提取物、l-谷氨酸钠和kh2po4混合制备用于生产杆菌霉素d的发酵培养基，虽然提高了枯草芽孢杆菌发酵培养生产杆菌霉素d的产量，但是培养基的制备方法比较复杂；因此急需一种提高杆菌霉素d产量的、制备简单的发酵培养基。

技术实现要素：

3.本发明的目的是提供了乳酸钙在提高枯草芽孢杆菌合成杆菌霉素d的应用，将乳酸钙添加在发酵培养基中对枯草芽孢杆菌进行发酵培养生产杆菌霉素d，能够提高杆菌霉素d的产量。
4.为了解决上述技术问题，本发明提出以下技术方案：
5.本发明提供了乳酸钙在提高枯草芽孢杆菌合成杆菌霉素d的应用。
6.优选的，所述乳酸钙包括l-乳酸钙。
7.本发明提供了一种乳酸钙发酵培养基，所述乳酸钙发酵培养基以水为溶剂，包含以下浓度的组分：酵母膏0.5～1.0g/l、l-谷氨酸2.0～5.0g/l、葡萄糖5.0～20.0g/l和乳酸钙3.5～9.5g/l。
8.本发明提供了一种提高杆菌霉素d产量的方法，包括以下步骤：采用上述技术方案所述乳酸钙发酵培养基对枯草芽孢杆菌种子液进行发酵培养获得杆菌霉素d；所述发酵培养过程分批补料乳酸钙发酵培养基。
9.优选的，所述发酵培养过程中分批补料乳酸钙发酵培养基的次数为3次；
10.所述发酵培养的条件包括：所述枯草芽孢杆菌种子液接种于乳酸钙发酵培养基后培养48～84h后补加新的乳酸钙发酵培养基，随后每隔15～21h补加新的乳酸钙发酵培养基，最后一次补料发酵后获得发酵液。
11.优选的，每次补加的新的乳酸钙发酵培养基的体积为初始的乳酸钙发酵培养基体
积的30％～55％。
12.优选的，所述发酵培养的温度为30～37℃，转速为150～200r/min；所述发酵培养的总时间为108～192h。
13.优选的，所述枯草芽孢杆菌种子液的接种量为乳酸钙发酵培养基体积的3％～5％。
14.优选的，所述枯草芽孢杆菌的种子液的制备包括：枯草芽孢杆菌接种于种子培养基，于33～37℃培养至种子培养基的od
600
为0.8～1.0获得枯草芽孢杆菌种子液。
15.优选的，所述杆菌霉素d包括杆菌霉素d c14同系物、杆菌霉素d c15同系物、杆菌霉素d c16同系物和杆菌霉素d c17同系物中的一种或多种。
16.本发明的有益效果：本发明提供了乳酸钙在提高枯草芽孢杆菌合成杆菌霉素d的应用，利用乳酸钙配制发酵培养基对枯草芽孢杆菌进行发酵培养可以提高杆菌霉素d的产量。本发明乳酸钙能促进芽孢杆菌的杆菌霉素d合成酶基因表达进而有效提高杆菌霉素d的产量。实施例结果表明：应用本发明提供的乳酸钙发酵培养基对枯草芽孢杆菌进行发酵培养获得的杆菌霉素d的产量明显提高。
具体实施方式
17.本发明提供了一种乳酸钙在提高枯草芽孢杆菌合成杆菌霉素d的应用。
18.在本发明中，所述乳酸钙优选包括l-乳酸钙。本发明所述乳酸钙能促进杆菌霉素d合成酶基因表达进而有效提高枯草芽孢杆菌合成杆菌霉素d的产量。本发明对所述l-乳酸钙的来源没有特殊限定，采用常规的市售产品即可。
19.本发明提供了一种乳酸钙发酵培养基，所述乳酸钙发酵培养基以水为溶剂，包含以下浓度的组分：酵母膏0.5～1.0g/l、l-谷氨酸2.0～5.0g/l、葡萄糖5.0～20.0g/l和乳酸钙3.5～9.5g/l。在本发明乳酸钙发酵培养基中，所述乳酸钙优选包括l-乳酸钙。
20.在本发明中，所述乳酸钙发酵培养基包括酵母膏0.5～1.0g/l，优选为0.8～1.0g/l，更优选为1.0g/l。本发明酵母膏补充枯草芽孢杆菌杆菌生长繁殖中需要的蛋白质、微量元素等，促进杆菌霉素d合成酶基因表达提高枯草芽孢杆菌合成杆菌霉素d的产量。
21.在本发明中，所述乳酸钙发酵培养基包括葡萄糖5.0～20.0g/l，优选为15.0～20.0g/l，更优选为20.0g/l。本发明葡萄糖可以促进促进杆菌霉素d合成酶基因表达提高枯草芽孢杆菌合成杆菌霉素d的产量。
22.在本发明中，所述乳酸钙发酵培养基包括l-谷氨酸2.0～5.0g/l，优选为4.0～5.0g/l，更优选为5.0g/l。本发明l-谷氨酸可以促进杆菌霉素d合成酶基因表达提高枯草芽孢杆菌合成杆菌霉素d的产量。
23.在本发明中，所述乳酸钙发酵培养基包括乳酸钙3.5～9.5g/l，优选为5～8g/l，更优选为6.5g/l。本发明所述乳酸钙能促进杆菌霉素d合成酶基因表达进而有效提高枯草芽孢杆菌合成杆菌霉素d。
24.生产杆菌毒素d的基础培养基组分为酵母膏，l-谷氨酸和葡萄糖，本发明以生产杆菌毒素d的基础培养基为基础，通过在基础培养中添加乳酸钙，得到乳酸钙发酵培养基，以乳酸钙发酵培养基为基础，并通过分批补料发酵生产杆菌霉素d，提高杆菌霉素d产量。
25.本发明利用乳酸钙发酵培养基能高效发酵生产杆菌霉素d，成本低廉，操作简单，
实用性高。本发明所述乳酸钙发酵培养基的灭菌条件优选为115℃，20min。
26.本发明提供了一种提高杆菌霉素d产量的方法，包括以下步骤：采用上述技术方案所述乳酸钙发酵培养基对枯草芽孢杆菌种子液进行发酵培养获得杆菌霉素d；所述发酵培养过程分批补料乳酸钙发酵培养基。
27.本发明优选直接应用斜面保藏的枯草芽孢杆菌制备枯草芽孢杆菌种子液。
28.本发明所述斜面保藏时应用的培养基组分优选包括3.0g/l牛肉浸膏，10g/l胰蛋白胨，5g/l氯化钠，15g/l琼脂和水1l。
29.本发明优选利用灭菌的竹签挑取斜面保藏的枯草芽孢杆菌接种于种子培养基中进行种子培养获得枯草芽孢杆菌种子液。在本发明中，所述种子培养优选为恒温培养，恒温培养温度优选为33～37℃，进一步优选为35～37℃，更优选为37℃；本发明优选培养至枯草芽孢杆菌种子液od
600
为0.8～1.0，更优选为0.9即可。在本发明中，所述种子培养优选为液体培养，所述种子培养基的组成优选包括3.0g/l牛肉浸膏、10g/l胰蛋白胨、5g/l氯化钠和水1l。
30.本发明对所述固体培养基和种子培养基的灭菌条件无特殊限定，采用常规的灭菌条件即可。
31.获得枯草芽孢杆菌种子液后，本发明将所述枯草芽孢杆菌种子液接种于乳酸钙发酵培养基进行发酵培养获得发酵液。在本发明中，所述接种时枯草芽孢杆菌种子液的体积优选为乳酸钙发酵培养基体积的4～6％，进一步优选为4.5～6％，更优选为5％。
32.本发明所述乳酸钙发酵培养基在上文已经论述，在此不再赘述。
33.在本发明中，所述发酵培养的温度优选为30～37℃，进一步优选为32～35℃，更优选为33℃。本发明所述发酵培养的转速优选为150～200r/min，进一步优选为170～190r/min，更优选为180r/min。
34.在本发明中，所述发酵培养优选为补料分批发酵培养，本发明所述发酵培养过程分批补料乳酸钙发酵培养基。在本发明中，所述发酵培养的时间优选为108～192h，进一步优选为120～170h，更优选为162h。本发明所述发酵培养时间优选包括补加乳酸钙培养基之前的发酵培养时间和补加乳酸钙培养基之后的发酵培养总时间，即发酵培养的总时间；补加乳酸钙培养基之后的发酵培养时间包括第一次补加乳酸钙培养基之后的培养时间、第二次补加乳酸钙培养基之后的培养时间和第三次补加乳酸钙培养基之后的培养时间。本发明所述补加乳酸钙培养基之前的发酵培养时间优选为48～84h，进一步优选为56～72h，更优选为66h。
35.本发明所述发酵培养过程中分批补料乳酸钙发酵培养基的次数优选3次。
36.本发明所述补料分批发酵的条件优选包括：所述枯草芽孢杆菌种子液接种于乳酸钙发酵培养基培养48～84h后补加新的乳酸钙发酵培养基，随后每隔15～21h补加新的乳酸钙发酵培养基，最后一次补料发酵后获得发酵液。在本发明中，每次补加新的乳酸钙发酵培养基的时间间隔优选为15～21h，进一步优选为16～20h，更优选为18h。
37.在本发明中，每次补加的新的乳酸钙发酵培养基的体积优选为初始的乳酸钙发酵培养基体积的30％～55％，进一步优选为38％～53％，更优选为50％。本发明补加的新的乳酸钙发酵培养基及补加的新的乳酸钙发酵培养基的体积参数的选择可以提高枯草芽孢杆菌发酵生产杆菌霉素d的产量。
38.在本发明中，当所述补料的次数为3次时，所述补料分批发酵的条件优选为：将枯草芽孢杆菌种子液接入初始乳酸钙发酵培养基中进行发酵培养，记为第1次发酵培养，向第1次发酵培养液中补加新鲜的乳酸钙发酵培养基，进行发酵培养，记为第2次发酵培养，向第2次发酵培养液内补加新鲜的发乳酸钙酵培养基，进行发酵培养，记为第3次发酵，向第3次发酵培养液内添加新鲜乳酸钙发酵培养基，进行发酵培养获得枯草芽孢杆菌发酵液。在本发明中，补料次数为3次时，枯草芽孢杆菌发酵生产的杆菌霉素d的效果较好，总杆菌霉素d的含量最高为1.01
±
0.02g/l，粗肽中总杆菌霉素d含量为38.06
±
0.72mg/g。
39.获得枯草芽孢杆菌发酵液后，本发明优选对枯草芽孢杆菌发酵液进行离心、酸沉和萃取获得杆菌霉素d。本发明所述离心的转速优选为5800～6200r/min，更优选为6000r/min，离心时间优选为13～17min，更优选为15min。
40.本发明将枯草芽孢杆菌发酵液离心，获得上清液。本发明优选对上清液进行酸沉浸提杆菌霉素d粗肽。在本发明中，所述酸沉的方式优选包括：利用hcl将上清液的ph值调至2.0以下，室温静置4h，室温静置4h后酸沉结束获得酸沉后的上清液；随后对酸沉后的上清液进行第二次离心，第二次离心的转速优选为5800～6200r/min，更优选为6000r/min，第二次离心时间优选为8～12min，更优选为10min；第二次离心后获得酸沉后的上清液粗肽沉淀，即为杆菌霉素d粗肽沉淀。
41.酸沉后，本发明优选对获得的杆菌霉素d粗肽沉淀进行萃取和第三次离心，获得含有杆菌霉素d的上清液，本发明优选利用甲醇进行萃取，本发明所述甲醇优选为谱纯甲醇。本发明所述萃取的时间为68～82min，进一步优选为70～75min，更优选为72min。本发明所述粗肽沉淀与甲醇的质量体积比优选为0.1～0.5g：0.5～2.0ml，进一步优选为0.3～0.5g：1.0～1.8ml，更优选为0.4g：1.5ml。本发明所述第三次离心的转速优选为9000～11000r/min，更优选为10000r/min，离心时间优选为8～12min，更优选为10min。
42.枯草芽孢杆菌发酵液进行三次离心、酸沉和萃取获得含有杆菌霉素d的上清液，本发明优选采用高效液相谱(hplc)法对含有杆菌霉素d上清液中的杆菌霉素d及其同系物的含量进行测定。本发明所述杆菌霉素d包括杆菌霉素dc14同系物、杆菌霉素dc15同系物、杆菌霉素dc16同系物和杆菌霉素dc17同系物中的一种或多种。在本发明中，所述杆菌霉素dc14同系物为十四碳β-氨基脂肪酸环七肽(c
14-β-nh2cooh-asn-tyr-asn-proglu-ser-thr)；所述杆菌霉素dc15同系物为十五碳β-氨基脂肪酸环七肽(c
15-β-nh2cooh-asn-tyr-asn-proglu-ser-thr)；所述杆菌霉素dc16同系物为十六碳β-氨基脂肪酸环七肽(c
16-β-nh2cooh-asn-tyr-asn-proglu-ser-thr)；所述杆菌霉素dc17同系物为十七碳β-氨基脂肪酸环七肽(c
17-β-nh2cooh-asn-tyr-asn-proglu-ser-thr)。利用本发明的技术方案枯草芽孢杆菌发酵生产杆菌霉素d的总产量、杆菌霉素dc14同系物产量、杆菌霉素dc15同系物产量、杆菌霉素dc16同系物产量和杆菌霉素dc17同系物产量均提高。
43.本发明结合乳酸钙能促进杆菌霉素d合成酶基因表达进而有效提高枯草芽孢杆菌合成杆菌霉素d的特点，创制用于生产杆菌霉素d的乳酸钙发酵培养基，并采用补料分批发酵生产杆菌霉素d，显著提高了杆菌霉素d的产量，这为实现杆菌霉素d大规模的工业化应用提供了科学合理的技术基础。
44.为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
45.实施例1
46.(1)培养基
47.乳酸钙发酵培养基组分：酵母膏1.0g/l、l-谷氨酸5.0g/l、葡萄糖20.0g/l、l-乳酸钙6.5g/l和1l水。乳酸钙发酵培养基115℃灭菌20min，冷却至室温后应用。
48.斜面保藏培养基组分：牛肉浸膏3.0g/l、胰蛋白胨10g/l、氯化钠5g/l和琼脂15g/l。
49.种子培养基组分：牛肉浸膏3.0g/l，胰蛋白胨10g/l和氯化钠5g/l。
50.(2)补料分批发酵培养
51.用灭菌竹签挑取斜面保藏的枯草芽孢杆菌菌落接入种子培养基，于37℃摇瓶培养至枯草芽孢杆菌种子液od
600
为0.8，获得枯草芽孢杆菌种子液。
52.按体积比5％的接种量将枯草芽孢杆菌种子液接入体积为300ml的乳酸钙发酵培养基中，接种后在温度为33℃，180r/min的条件下进行发酵培养，记为第1次发酵。
53.从开始培养计时：第1次发酵至培养66h时，向第1次发酵液中添加新鲜的乳酸钙发酵培养基150ml，于温度为33℃，180r/min的条件下继续发酵培养，记为第2次发酵培养。第2次发酵培养至84h时，向第2次发酵培养液内添加新鲜的乳酸钙发酵培养基150ml，于温度为33℃，180r/min的条件下继续发酵，记为第3次发酵培养，第3次发酵培养至102h时，向第3次发酵培养液内添加新鲜发酵培养基150ml，于温度为33℃，180r/min的条件下继续发酵至162h获得枯草芽孢杆菌发酵液。即分批补料乳酸钙发酵培养基的次数为3次。补加乳酸钙发酵培养基前的发酵时间为66h，补加第1次培养基之后的发酵时间为18h，补加第二次发酵培养基之后发酵18h补加第3次发酵培养基，补加第3次发酵培养基之后继续发酵60h，获得枯草芽孢杆菌发酵液。总发酵时间为162h。
54.取40.0ml枯草芽孢杆菌发酵液于6000r/min离心15min，弃菌体，取枯草芽孢杆菌发酵液的上清液，用hcl将上清液ph调至2.0以下浸提粗肽，室温静置4h，随后在6000r/min的条件下离心10min，得到杆菌霉素d粗肽沉淀。
55.在0.4g杆菌霉素d粗肽沉淀中加入1.5ml甲醇萃取72min，将所得粗肽萃取液在10000r/min的条件下离心10min后取上清液即为含有杆菌霉素d的溶液。利于甲醇萃取的优势在于有效萃取杆菌霉素d。采用高效液相谱(hplc)法对含有杆菌霉素d的溶液中的杆菌霉素d及其同系物的含量进行测定。
56.实施例1共5组平行实验。
57.实施例2
58.发酵培养基中添加l-乳酸钙，l-乳酸钙的添加量为3.5g/l，其余条件同实施例1。
59.实施例3
60.发酵培养基中添加l-乳酸钙，l-乳酸钙的添加量为9.5g/l，其余条件同实施例1。
61.对比例1
62.不进行补料，其余条件同实施例1。
63.对比例2
64.发酵培养基中不添加l-乳酸钙，其余条件同实施例1。
65.对比例3
66.发酵培养基中添加氯化钙，其余条件同实施例1。
67.对比例4
68.发酵培养基中添加l-乳酸钙，l-乳酸钙的添加量为0.5g/l，其余条件同实施例1。
69.对比例5
70.发酵培养基中添加l-乳酸钙，l-乳酸钙的添加量为12.5g/l，其余条件同实施例1。
71.对实施例1～3和对比例1～5获得的枯草芽孢杆菌发酵液中的杆菌霉素d及其同系物的含量进行测定，测定方法采用高效液相谱(hplc)法。具体hplc条件和测定方法参照现有技术(qian shiquan,lu hedong,meng panpan,zhang chong,lv fengxia,bie xiaomei,lu zhaoxin,effect of inulin on efficient production and regulatory biosynthesis ofbacillomycin d in bacillus subtilis fmbj,bioresource technology,2015,179:260-267.)进行。对实施例1～3和对比例1～5的5次平行实验的测定值见表1。
72.表1实施例1～3和对比例1～5获得的枯草芽孢杆菌发酵液中的杆菌霉素d及其同系物的含量(g/l)和粗肽中杆菌霉素d含量(mg/g)
[0073][0074]
根据表1可知，本发明以乳酸钙发酵培养基为基料进行三次补料发酵，有效提高了枯草芽孢芽孢杆菌的杆菌霉素d产量。
[0075]
实施例4杆菌霉素d对黄曲霉的抑制效果
[0076]
pda培养基：200g/l马铃薯、20g/l葡萄糖、18g/l琼脂和1l水。
[0077]
验证实施例1制备得到的杆菌霉素d对黄曲霉(cicc2062)的抑制效果。使用pda平板于温度为28℃培养黄曲霉4天后，取5mm菌丝块，将菌丝面朝下放置于含有不同浓度杆菌霉素d的pda平板上于28℃静置培养5天作为试验组，试验组1～7的pda平板中杆菌霉素d浓度依次为5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、160μg/ml、320μg/ml，以不含杆菌霉素d的pda平板为对照组。
[0078]
培养5d后，采用十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝抑制率。
[0079]
培养5d后，在试验组1～7和对照组的pda平板中加入无菌水5.0ml，用无菌水洗下孢子，用血球计数板计数，测定黄曲霉孢子数。结果见表2。
[0080]
黄曲霉菌丝和孢子抑制率计算公式如下：菌丝抑制率(％)＝{(未经杆菌霉素d处
理的黄曲霉菌落直径-经杆菌霉素d处理的黄曲霉菌落直径)/(未经杆菌霉素d处理的菌落直径)}
×
100％；
[0081]
孢子抑制率(％)＝{(未经杆菌霉素d处理的黄曲霉菌落孢子数-经杆菌霉素d处理的黄曲霉菌落孢子数)/(未经杆菌霉素d处理的菌落孢子数)}
×
100％。
[0082]
由表2可知，当添加320μg/ml杆菌霉素d时，能完全抑制黄曲霉的生长，可见本发明的技术方案制备得到的杆菌霉素d能够抑制黄曲霉的生长，说明本发明技术方案制备得到的杆菌霉素d的纯度较高。
[0083]
表2杆菌霉素d对黄曲霉抑制作用
[0084][0085]
综上，本发明利用乳酸钙配制发酵培养基对枯草芽孢杆菌进行发酵培养可以提高杆菌霉素d的产量，获得杆菌霉素d对黄曲霉有较好的抑制作用。
[0086]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：

1.乳酸钙在提高枯草芽孢杆菌合成杆菌霉素d的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述乳酸钙包括l-乳酸钙。3.一种乳酸钙发酵培养基，其特征在于，所述乳酸钙发酵培养基以水为溶剂，包含以下浓度的组分：酵母膏0.5～1.0g/l、l-谷氨酸2.0～5.0g/l、葡萄糖5.0～20.0g/l和乳酸钙3.5～9.5g/l。4.一种提高杆菌霉素d产量的方法，其特征在于，包括以下步骤：采用权利要求3所述乳酸钙发酵培养基对枯草芽孢杆菌种子液进行发酵培养获得杆菌霉素d；所述发酵培养过程分批补料乳酸钙发酵培养基。5.根据权利要4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养过程中分批补料乳酸钙发酵培养基的次数为3次；所述发酵培养的条件包括：所述枯草芽孢杆菌种子液接种于乳酸钙发酵培养基后培养48～84h后补加新的乳酸钙发酵培养基，随后每隔15～21h补加新的乳酸钙发酵培养基，最后一次补料发酵后获得发酵液。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，每次补加的新的乳酸钙发酵培养基的体积为初始的乳酸钙发酵培养基体积的30％～55％。7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为30～37℃，转速为150～200r/min；所述发酵培养的总时间为108～192h。8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌种子液的接种量为乳酸钙发酵培养基体积的4％～6％。9.根据权利要求4或8所述的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌种子液的制备包括：枯草芽孢杆菌接种于种子培养基，于33～37℃培养至种子培养基的od
600
为0.8～1.0获得枯草芽孢杆菌种子液。10.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述杆菌霉素d包括杆菌霉素d c14同系物、杆菌霉素d c15同系物、杆菌霉素d c16同系物和杆菌霉素d c17同系物中的一种或多种。

技术总结

本发明属于本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及乳酸钙在提高枯草芽孢杆菌合成杆菌霉素D的应用和乳酸钙发酵培养基及方法。本发明提供了乳酸钙在提高枯草芽孢杆菌合成杆菌霉素D的应用，对枯草芽孢杆菌进行发酵培养时利用乳酸钙配制发酵培养基可以提高杆菌霉素D的产量。本发明乳酸钙能促进芽孢杆菌的杆菌霉素D合成酶基因表达进而有效提高杆菌霉素D的产量。实施例结果表明：应用本发明提供的乳酸钙发酵培养基对枯草芽孢杆菌进行发酵培养获得的杆菌霉素D的产量明显提高。获得的杆菌霉素D的产量明显提高。