微生物抗菌素敏感试验----3d81e25e-715e-11ec-80b9-7cb59b590d7d 抗菌素敏感试验
1.掌握药敏试验（K-B纸片琼脂扩散法）的方法、原理和结果判断。2.掌握抗酸染方法及结果判断 （1） β-内酰胺类：青霉素类和头孢菌素类（硫酶、单酰基环β-内酰化酶抑制剂、甲氧基青霉素类）
（2）氨基糖甙类：链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、新霉素、核糖霉素、小诺霉素、阿奇霉素
（3） 大环脂质：红霉素、白霉素、乙酰螺旋霉素、麦地那霉素、交沙霉素（4）四环素：四环素、土霉素、金霉素、强力霉素（5）氯霉素：氯霉素、甲砜霉素
（6）作用于g+细菌的其它抗生素：林可霉素、氯林可霉素、万古霉素、杆菌肽（7）作 用于g-菌的其它抗生素：多粘菌素、磷霉素、、环丝氨酸、利福平、抗真菌抗生素、灰黄霉素
（8） 抗肿瘤抗生素：丝裂霉素、放线菌素D、博莱霉素和阿霉素（9）具有免疫抑制作用的抗生素：环孢素
2、抗菌药物敏感试验(antimicrobialsusceptibilitytestinginvitro)1）抑菌试验：体外测定抗菌药物抑制细菌生长能力的试验（1）纸片扩散法（discdiffusiontest）
K-B纸片琼脂扩散法原理：将含有定量抗生素的纸片贴在接种试验菌的琼脂平板上。纸张中的药物吸收琼脂中的水分并溶解，然后不断扩散到纸张周围区域，形成一个逐渐降低的梯度浓度。在纸张周围的抑菌浓度范围内，被测细菌的生长受到抑制，从而形成一个透明的抑菌圈。抑制区的大小反映了受试细菌对受试药物的敏感性，并与药物对受试细菌的最低抑制浓度（MIC）呈负相关。（2） 稀释试验
a.将被检菌株接种于一组含有不同稀释度抗菌药物的培养基内
b、 在37℃下放置18-24小时后，抗菌药物可以用肉眼抑制受试细菌生长的最低浓度（M
IC），即细菌对抗菌药物c.mic50mic90的敏感性
d.根据mic和常用剂量时该药所能达到的血药浓度来划定细菌对各种药物的敏感度或耐药的界限（breakpoint,折点)
（3） E试验（Etest）2）灭菌试验3）联合药敏试验
4）检测细菌所产生的抗生素灭活酶试验3、药物敏感性分级1）敏感（s）
这表明，在常规剂量的被测药物后，体内达到的血液药物浓度可以抑制或杀死被测细菌。2） 中级学位（一）
在敏感与耐药之间建立缓冲带，以减少因各种实验条件失控对实验结果的影响3）耐药（r） 这表明，常规剂量的药物给药后，人体内的血液药物浓度无法抑制受试细菌。4.结核分枝杆菌：
（1）形态与染：菌体细长略弯曲、有的呈分枝，抗酸染阳性-抗酸杆菌，诱导可变
为l型（much）
（2） 培养特性——贪婪、懒惰、丑陋：专性需氧菌，营养要求高——罗氏培养基，生长缓慢，固体培养基——粗糙、花椰菜状、液体培养基——表面生长成细菌膜。（3） 抵抗力
三抗：抗干燥、抗酸碱、抗碱性染料三敏感：湿热、紫外线、70-75%酒精
（4） 结核分枝杆菌的毒力和耐药性变异最为常见，长期用药后易产生耐药性（5）结核分枝杆菌的致病性：
疏水性阿拉伯-半乳聚糖-分枝菌酸
心形因子（海藻糖克拉维酸盐）抑制线粒体呼吸
蜡质d(分枝菌酸与糖肽脂的复合物)：具有免疫佐剂作用磷脂-与结核结节的形成有关
脑苷酸硫酸盐抑制吞噬体和溶酶体5的融合。抗酸原理
1）分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，主要是分枝菌酸，它包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着，要经过加热和延长染时间来促使其着。但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱剂脱，故名抗酸染。
2） Ziegler-Nissl酸快速染法是在加热条件下使分枝杆菌酸和石炭酸变红并牢固固化形成复合物，经盐酸和乙醇处理后不会脱。当添加碱性亚甲基蓝时，分枝杆菌仍然是红的，而背景中的其他细菌和物质是蓝的。
金葡培养液：3套/桌；接种用棉棒儿：1支/人；mh琼脂平板：1块/人；各种抗菌纸片：3套/桌；镊子：1把/人；acid-fast初染剂：1瓶/2人；结核杆菌涂片：1张/人；滤纸：1张/人
1.抗生素敏感性试验
1）用无菌棉棒儿蘸取菌液（金葡）
2） 轻轻旋转并挤出液位以上管壁中多余的菌液，在MH琼脂平板的整个平面上涂抹三次，每次旋转60度，最后沿平板内边缘涂抹一周，以获得均匀接种。3） 盖上盘子，在室温下干燥3分钟
4）无菌操作，用镊子将药敏纸片贴在涂好菌的平板上，各纸片中心相距至少24mm，纸片距平板内缘应大于15mm
6） 37℃下18-24小时后测量抑菌圈直径
1）初染：用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红2-3滴，在火焰高处徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开，若染液蒸发减少，应再加染液，以免干涸，加热5分钟，待标本冷却后用水冲洗。
2） 脱：3%盐酸乙醇脱30s~1min；用水冲洗。
3）复染：用碱性美兰溶液复染1min，用水冲洗后用吸水纸吸干。4）用油镜观察
1.抗生素敏感性试验结果见下表1：不同抗生素抑菌圈宽度的测定
penicillin的抑菌环几乎没有，说明实验室的金葡对于青霉素耐药。2．抗酸染结果
抗酸染后，分枝杆菌被染成红。
六、思考与讨论
影响药敏试验结果的主要因素1。药物因素1）药物的物理化学性质
（1）药物溶解性：药品的溶解性决定了其能否在培养基上均匀扩散，难溶的药物无法完全扩散，所得实验结果会小于真实值。
药物稳定性：临床常用的药物试纸条一般都是预先加工的，现在很少使用和制作，因此药物试纸条中的药物含量一定会受到其稳定性的影响。对于本实验中使用的抗生素：
i.青霉素类在自然条件下是非常不稳定的，如青霉素钠或钾无论在酸性还是在碱性溶
它会在溶液中迅速分解，因此在处理药敏试纸的过程中，当试纸放置在培养基上时，溶剂和培养基的pH值会降低药物效价和药敏结果。二、红霉素也是一种非常不稳定的药物。在弱碱条件下相对稳定，但当pH值小于6时
红霉素会很快分解，导致药敏试验结果的降低。
2） 药物作用特点
（1）药物抗菌作用机理：临床中的抗菌药物可以简单的分成抑菌药物和杀菌药物两种。
杀菌药物产生的抑菌环边沿一般是非常明晰清楚，而抑菌药物产生的抑菌环边沿是模糊的。所以在药敏试验结果判断上，抑菌药物和杀菌药物抑菌环（带）大小很难确定，并且随着培养时间的延长和药物的失效，抑菌药物抑菌环（带）边沿未被杀死的细菌有可能又恢复生长，从而导致抑菌环（带）的进一步缩小。针对本次实验使用的抗菌药物：i.抑菌药物有：青霉素、红霉素、万古霉素ii.杀菌药物有：庆大霉素
（2） 合适的pH值：有最适合药物效果的pH值
（3）药物有效部位：有些药物的抗菌作用是不能通过体外药敏试验来判断的，它们只有在体内进一步分解（或转化）后才能表现出抗菌作用
（4） 离子的影响：许多常用药物会受到各种离子的影响，导致抗菌效果降低甚至丧失。例如，许多重金属离子（铜、锌、汞）会破坏青霉素钠（或钾）的活性，降低其抗菌效果。因此，药敏试验应采用非离子水和优质营养琼脂。
（5）其他因素：药物自身性质影响因素还包括药物蛋白结合率、作用温度等多方面因素。2、培养基
1） 培养基厚度：影响药物的扩散。培养基的厚度越大，药物的抗菌环越小。抑菌试验中常用的培养基厚度一般为5mm左右。
2）用水的质量：主要是矿物质离子的影响，如ca2+、mg2+、al3+等离子，它们可能使某些药物失活。
3） PH值：影响药物的稳定性和活性。。
4）培养基成分：培养基配制浓度较高或融化不良以及厚薄不均等均可能影响药物扩散；培养基中的蛋白质可能和部分蛋白质结合率高的药物结合而影响药敏试验结果。药物蛋白质结合率如：青霉素≧50%、红霉素≧70%；而氨基糖苷类药物结合率却很低（20%左右）。培养基中的杂质的种类也可能在某些方面影响药敏试验的结果。3、细菌因素
细菌层的厚度（或包被细菌的数量）和细菌生长特性是影响药物敏感性结果的主要因素。有一定比例的药物可以杀死细菌。药敏试验培养基上的细菌层越厚，抑菌环越小，反之抑菌环越大。一些细菌在培养基上生长时会移动（鞭毛移动）。当药物失效或培养时间过长时，这些细菌可能会移动到形成的抑菌环上，这也会导致抑菌效果判断的错误。4.试卷因素
1）药物含量的多少：试纸片上药物含量的多少应该是影响药敏结果的最主要因素。由于纸片法药敏试验本身就是一种定物敏感性试验，试纸片含药量没有统一规定，各个生产单位都是根据各自的标准进行加工，所以试纸片药物种类和含量不同判断标准也不同，药物之间没有明确的可比性。目前许多兽药企业自己生产药敏试纸片和产品的药敏试纸片，有的企业为了提高产品的药敏结果而加大产品药敏纸片中药物含量也在所难免，所以通过药敏试验中抑菌环大小来判断细菌对不同药物的敏感性是不严谨的。
2） 试纸材料：在药敏试纸中，试纸材料对药物的稳定性和活性有很大影响。用于处理药敏试纸的试纸一般为加厚的定性或定量滤纸。该滤纸杂质含量少，对药品保存影响不大。然而，在临床实践中，许多企业处理纸片并使用普通纸张。这些普通纸张通常是碱性的，或用水浸泡后含有大量无机离子。用普通纸张处理的试纸药物受到很大影响。一些企业也使用薄滤纸。在加工过程中，滤纸不能均匀吸收药物。试纸中药物含量的不均匀不可避免地会导致药敏试验结果的不确定性。5.培养条件
药敏试验中培养时间的长短、温度的高低等都是影响药敏试验结果的因素。抑菌药物的抑菌环边沿是一个模糊范围，当培养时间过长或药物失效，药物的抑菌环大小也就会发生
改变；细菌的移动性在培养时间过长时也会影响试验结果的判断；培养温度的高低可以影响细菌的生长状况，这也间接影响药敏试验的结果。
“临床纸片法药敏试验结果影响因素分析”，来自中国家禽疾病网
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