摘要：破伤风是一种严重危害人民生命健康的疾病,当今仍然是一个世界性的难题,在广大贫困落后的第三世界的国家和地区更为严重。本文主要介绍破伤风类毒素的发展历史以及应用和研究进展。
关键词：破伤风； 类毒素； 研究； 应用
一些经变性或经化学修饰而失去原有毒性而仍保留其免疫原性的毒素。 某些细菌外毒素可用甲醛等处理后脱毒的制品，毒性虽消失，但免疫原性不变，故仍然具有刺激人体产生抗毒素，以起到机体从此对某疾病具有自动免疫的作用。它们广泛地应用于预防某些传染病。如向人体注射白喉类毒素后可以预防白喉。其他的还有破伤风类毒素、葡萄球菌类毒素、类毒素等。亦可把它们注射到动物体内用于制备抗毒素。细菌的外毒素经甲醛处理后，失去毒性而仍保留其免疫原性，能刺激机体产生保护性免疫的制剂。常用的甲醛溶液的浓度是0.3～0.4％。它可使细菌外毒素的电荷发生改变，封闭其自由氨基，产生甲烯化合物（CH2=N-）。其他基团（如吲哚异吡唑环）与侧链的关系亦可改变，成为类毒素。
常用的类毒素有白喉类毒素，破伤风类毒素。另外，若在类毒素中加入适量的磷酸铝或氢氧化铝，即成吸附精制类毒素。该类制剂在体内吸收较慢，能较长时间刺激机体，使机体产生高滴度抗体，增强免疫效果。类毒素也可与死疫苗混合制成联合疫苗。如百白破三联疫苗，就是由百日咳死菌苗、白喉类毒素、破伤风类毒素混合制成的。主要用于儿童，注射后可同时预防儿童易发的白喉、百日咳、破伤风三种疾病。类毒素在预防由外毒素引起的传染病中起重要作用，可用于人和动物的免疫接种，使其通过人工自动免疫获得抗病能力；还可用来免疫动物，再从动物血液中提取含抗毒素的血清，将此抗血清注入人体后，可使人体通过被动免疫的方式，立即获得相应的特异性免疫力。 1 破伤风类毒素的发展历史
破伤风是一种严重危害人民生命健康的疾病,当今仍然是一个世界性的难题,在广大贫困落后的第三世界的国家和地区更为严重。据估计,全世界每年有几十万至一百万的死亡病例,死于破伤风的80%为新生儿[1、2]。人们为了认识、和预防破伤风作出了不懈的努力。早在1884年,Nicolarier通过动物试验发现了破伤风与泥土中的细菌有关。1889年,Kitasato分离出纯的病原体。1890年Kund Faber证明了给动物注射培养物的滤液而产生破伤风的症状,
是因为有一种毒素的存在。同年,Von Behring和kitasato用减弱的毒素免疫家兔制备出破伤风抗毒素。最初试图用抗毒素人的破伤风,证明对有明显破伤风症状的患者,基本上是无效的。抗毒素仅能用作应急预防,有效预防时间短,且反复大量地使用马血清可能引起血病。1923年,Ramon报告用甲醛和热处理毒素的方法,制备出了有抗原性的类毒素。1926年,Ramon和Zeoller用破伤风类毒素成功地给人进行了免疫,从而开创了类毒素预防免疫的新时代[2,3]。
最初普遍使用的是原制破伤风类毒素,这种原制的类毒素免疫效果是好的,但接种后的付反应很大,甚至有过敏性休克死亡的事例。这主要是由于原制类毒素中存在着大量的培养基中的无关蛋白成分,引起过敏反应。[2,3]以后注意了培养基的成分,但收效甚微。为了减轻接种的付反应,之后对原制类毒素进行了精制提纯,制备出了精制的破伤风类毒素。经过使用观察,精制破伤风类毒素的接种反应比原制类毒素的接种反应显著地减少,但免疫学效果不如原制的类毒素。为了提高精制破伤风类毒素的免疫效果,人们开展了佐剂疫苗的研究。1940年,Holt用磷酸铝吸附精制的类毒素,既降低了接种的付反应,又提高了免疫学效果。经过不断的改进,直到今天世界各国基上都采用铝佐剂吸附精制破伤风类毒素制剂。破伤风类毒素的
制备有二个重要的进展:(1)采用了半合成〈综合〉培养基,减少了引起过敏反应的大分子物质。(2)应用发酵罐进行了工业化生产,为大规模地人免疫接种,提供了充足的保证。[2]我所经过几年的探索,于1978年正式用发酵罐进行破伤风细菌的培养。
2 破伤风类毒素的现状
目前,精制破伤风类毒素的生产工艺主要有两种:(1)先脱毒后精制;(2)先精制后脱毒。据认为第一种工艺生产的类毒素稳定性一般较好,但是原素中含有大量的培养基成分,在脱毒过程中,容易通过甲醛与毒素分子交联,提纯比较困难。此外,脱毒的体积大,操作不便。第二种工艺生产的精破类纯度高,脱毒体积小,便于操作,且没有发现毒性逆转的现象,更适合大罐培养后的生产。[2]国外专家推荐采用第二种工艺。我所有1978年以来,一直采用第二种工艺生产精制破伤风类毒素。现在广泛应用的破伤风类毒素制剂有:(1)单价吸附的精制破伤风类毒素;(2)吸附的精制白喉-破伤风类毒素二联制剂;(3)吸附的精制白喉-破伤风类毒素-百日咳菌苗三联制剂(DTP)。这些制剂为预防、控制破伤风、降低破伤风的发病率起了很重要的作用。吸附的精制破伤风类毒素经过几十年的实际运用,其免疫学效果是肯定的和明显的,也是一种比较安全的免疫制剂。但是在大规模地人接种时,仍有不良反应发生。反应是局部的
或全身的,反应的程度也不同。除了引起速发型,迟发型及Arthus 反应外,在很少的病例中发现接种后出现的神经系统并发症和周围神经炎,或脑性昏迷。也有由O型母亲生下的A.B.O不相容性的新生儿中有增加溶血性疾病的危险性[2]。引起不良反应的原因主要是类毒素的纯度不高,高纯度的制品不良反应低;或者是由于吸附剂引起,铝佐剂除引起接种者不舒服外,还有引起过敏反应,甚至死亡的报告。据研究铝化合物能促进IgE的形成。此外,类毒素本身是否也会引起过敏反应,尚可考虑[2]。
3 新型破伤风疫苗的研究进展
为了制备出更安全又有效的破伤风疫苗,世界各国仍在不懈努力。其研究的主要方向有:
3.1改进精制方法,制备出高纯度的精制破伤风类毒素
TT (精制破伤风类毒素)是由破伤风梭状芽胞杆菌产生的毒素,经甲醛脱毒后制成,是预防破伤风的有效生物制剂[4]。铝佐剂吸附TT具有副反应小,免疫效果好,免疫持久性长等特点,世界各国基本上都采用了铝佐剂吸附TT。
人体感染破伤风杆菌后,破伤风杆菌的痉挛毒素与中枢神经系统抑制突触前膜的神经节苷脂结合,阻断该突触释放抑制性介质,运动神经元抑制解除,骨骼肌持续兴奋,发生痉挛[4]。TT接种后,机体产生抗毒素免疫球蛋白,中和破伤风杆菌产生的毒素,可显著降低破伤风的发生。
3.1.1主要用途
吸附百日咳、白喉、破伤风联合疫苗(DTwP)的组分之一 该疫苗的接种对象为3个月~6岁的儿童[5]。作为计划免疫的一部分,是TT最重要、最广泛的用途。TT、百日咳菌苗原液、精制白喉类毒素分别按5 Lf/ml、(75~90)亿/ml、20 Lf/ml比例加入,同时用Al (OH)3胶体溶液作为佐剂配制成联合疫苗(DTP),用于预防小儿百日咳、白喉、破伤风3种疾病。
预防新生儿破伤风(NT) NT主要原因是使用未彻底灭菌的接生用具,破伤风杆菌或其芽胞经脐带残端血进入新生儿体内而发病[4]。资料表明,育龄妇女完成3剂吸附破伤风类毒素接种后,破伤风抗体阳性率可达90%以上,当育龄妇女的吸附破伤风类毒素3针接种率达87%以上时, NT发病率可降至1‰以下[6]。所以育龄妇女开展3针吸附破伤风类毒素接种是消除NT最经济、有效的措施。故有专家建议,将育龄妇女吸附破伤风疫苗接种纳入常规计划免疫。这在广大农村及卫生水平相对落后地区显得尤为重要。
用于生产人破伤风免疫球蛋白 人破伤风免疫球蛋白是健康人经吸附破伤风类毒素免疫后,采取其血浆,用低温乙醇法提取特异性免疫球蛋白并经病毒灭活获得高效人破伤风免疫球蛋白,用于破伤风的预防及。由于其为经人体免疫获得,因而无动物破伤风抗毒素引起的不良反应,如过敏性休克和血清病等,且用药量及用药次数均少。而静脉注射用抗破伤风免疫球蛋白,更可用于破伤风患者的,挽救病人的生命。研究表明,人破伤风免疫球蛋白预防及效果确切,这种产品已由成都生物制品研究所在国内独家生产,为人类控制和消灭破伤风提供了新的武器。
用于生产破伤风抗毒素(TAT) 破伤风抗毒素是对马用破伤风抗原免疫,抽取马血浆,经分离提纯后获得。外伤后及时注射,对预防破伤风有一定效果。但由于破伤风抗毒素内含有马血清等异种蛋白,易引起机体过敏反应,其生产工艺也相对落后,将逐渐为人破伤风免疫球蛋白所代替。
3.2亚单位疫苗的研究
目前,对于破伤风毒素的分子结构,理化性质的研究比较清楚。破伤风毒素在细菌细胞内以分子量大约为150000道尔顿的一条多肽链合成的,当细菌溶解时,细胞内的毒素就释放出来,在
内源性蛋白酶的作用下裂解成为细胞外毒素。破伤风毒素的结构示意图如下[16]:
细胞外毒素是由分子量约为50000道尔顿的一条轻链〈LC〉和分子量约为100000道尔顿的一条重链〈HC〉组成,二链之间由二硫键和非共价链相连,毒素的等电点(PI)为5.95-6.0,轻链〈LC〉PI为4.8,重链〈HC〉PI为7.2。根据新的命名法,破伤风毒素由A、B、C三个片断组
成,A片断即为轻链〈LC〉为毒素的活性部分,重链由BC二个片断组成,毒素与神经节苷脂的结合位点位于重链上,也就是C片断的羧基(-COOH)末端。重链的BC片断由肽键相连,可由木瓜蛋白酶裂解开,B、C片断的分子量大约均为50.000道尔顿,C片断的PI为7.3。[1,2,3,4,5,6]毒素可被A、B或C片断的单克隆抗体所中和,这就在理论上提出三种片断中的任何一种都可作为疫苗使用,A、B、C片断已成功地用于免疫小鼠抵抗破伤风。[4,6,7]用亚单位作为疫苗的主要缺点在于要求加工高纯度的毒素,而且链的分离和片断的提纯费时,耗资多,收获率低,难以大规模地生产。C亚单位的一个代替物是碎片β-Ⅱb,此物可以粗素用冻融的方法制成〈Biggini et al,1997〉[2,4]据报道,已成功地将破伤风毒素的C片断的基因进行了克隆化、核苷酸序列的测55定,以及在大肠杆菌中的表达[4]。这为用基因工程的方法生产C亚单位疫苗开创了良好的前景。
3.3改进破伤风毒素的类毒化的工艺
自70年代,国外曾报道用改进的新工艺制备新型破伤风类毒素获得成功。此种类毒素的类毒化是完全的,且是不可逆的,其免疫原性并不能因磷酸钙的吸附而增强,此种类毒素作为液体疫苗使用至少和传统的吸附精制破伤风类毒素有同样的免疫原性。这种无佐剂的疫苗曾成
功地运用于大量的婴幼儿,对此疫苗有很好的耐受性,没有见到明显的不良反应[2,8,9]。目前,铝剂对大脑神经组织的毒性作用日益受到重视,这种新型破类的研制具有具有很深远的意义。近年来,我所已成功地研制出这种新型的破类,初步应用于马匹免疫取得很大成功,并且对这种新型破类的一些理化和生物学特性进行了研[10,11]。
3.4其他新型疫苗
口服疫苗,国外已有成功的报道。但剂量比常规(注射)途径高10—50倍。[2]我所于70年代曾作过破类滴鼻免疫的研究,此种免疫途径作为类毒素的加强免疫是有效的,且无明显的付反应出现,但作为基础免疫所需的抗原量要求很高,且免疫效果仍须进一步的证实[12]。
参考文献：
[1] Bizzini B.Tetanus toxin.Microbiol.Rev.1979,43(2):224
[2] Bizzini B.Tetanus.In Germanier R(Editor),Bacterial Vac-cines.New York:Academic Press,1984,pp32
[3] 雷殿良,松田弘.破伤风毒素及其片断的纯化.中国生物制品学杂志1990,3(2):53
[4] 叶本善·厌氧型细菌∥童竞亚主编·医学免疫学与微生物学·第3版·北京:人民卫生出版社, 1998: 138-140·
[5] 中国生物制品标准化委员会编·吸附百日咳、白喉、破伤风联合疫苗制造及检定规程·北京:化学工业出版社, 2000: 61-64·
[6] 孙莲英,王春雷,吴多林,等·海南省育龄妇女破伤风类毒素接种与新生儿病例监测的流行病学效果·中国计划免疫, 2000, 6(6): 338-340·
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议