人工改造脱氨酶辅助的DNA中5-甲基胞嘧啶修饰单碱基分辨率定位分析方法与流程

人工改造脱氨酶辅助的dna中5-甲基胞嘧啶修饰单碱基分辨率定位分析方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种人工改造脱氨酶辅助的dna中5-甲基胞嘧啶修饰单碱基分辨率定位分析方法。

背景技术：

2.5-甲基胞嘧啶(5mc)是一种重要的dna甲基化修饰，广泛存在于真核生物和原核生物中。在哺乳动物基因组中，dna甲基转移酶能够将甲基转移到未修饰胞嘧啶的第5位碳原子上，形成5mc。其含量约占胞嘧啶的3％且几乎所有的5mc都存在于cpg二核苷酸中。已有大量事实证明，5mc参与了基因组印迹、基因表达调控、x染体失活以及转座子抑制等等复杂的生物过程。此外，5mc可以被tet蛋白逐步氧化为5-羟甲基胞嘧啶(5hmc)、5-醛基胞嘧啶(5fc)和5-羧基胞嘧啶(5cac)，形成新的修饰。基于5mc在一系列生理过程中的重要地位和发挥的关键作用，它也被誉为dna 中的“第五碱基”。迄今为止，对于5mc修饰的功能研究一直是核酸表观遗传学的研究热点。为了揭示该修饰精准的生物学功能，则需要依赖于高准确度的定位分析方法。
3.目前可以对5-甲基胞嘧啶进行单碱基分辨率测序的方法主要有两类，一是亚硫酸氢盐测序方法，另一类是利用生物活性酶介导的测序方法。传统的亚硫酸氢盐测序方法是一种广泛使用的dna中5mc单碱基分辨率测序方法。该方法是通过利用亚硫酸氢盐对未修饰的胞嘧啶(c)进行脱氨基而5mc及5hmc不能脱氨基的原理对dna进行处理；同样的，在处理过程中，5fc和5cac也会被亚硫酸氢盐脱氨基。在后续的测序过程中c被读作胸腺嘧啶(t)，这种由c到t的转化可以直接获得5mc和5hmc的定位信息。但是，基于亚硫酸氢盐的策略需要苛刻的化学脱氨条件，从而导致高达99.9％的dna被降解。而利用酶介导的测序方法目前有两种，一种是酶结合化学试剂吡啶的测序方法，该方法需要β-糖基转移酶将5hmc转化成5gmc，经加tet蛋白处理后，5mc可以转变成5cac，5cac会在化学试剂吡啶的作用下生成二氢尿嘧啶(dhu)在测序过程中读作t，而c和被保护的5hmc在测序过程中均被读作c。另外一种是采用三种酶介导的酶法测序方法，首先，采用tet蛋白和β-糖基转移酶将5mc和5hmc转化为脱氨酶apobec3a(人载脂蛋白b mrna编辑酶催化亚基3a，a3a)不能脱氨基的产物，然后采用a3a将未修饰的c脱氨转化为尿嘧啶(u)，在后续的测序中，只有c读作t，而5mc保持c。目前测定dna甲基化的酶学方法基本都需要多种生物酶的共同辅助，使得流程比较复杂，操作比较繁琐。
4.apobec3c(人载脂蛋白b mrna编辑酶催化亚基3c，a3c)蛋白是一种胞嘧啶脱氨酶，在病毒感染和癌症发生中具有非常关键的功能。野生型a3c(wta3c)可使单链dna中的c有效地脱氨基成为尿嘧啶，但相对于其对c的脱氨基能力而言，a3c蛋白对5mc的脱氨基能力要小得多。因此，a3c具有较好的c和5mc的底物脱氨筛选能力。如果对a3c蛋白进行改造使其保留对c的良好脱氨基能力但不能对5mc脱氨基，则可以直接对不同基序的5mc进行定位分析且不需要其他任何生物酶的辅助作用。

技术实现要素：

5.本发明首要解决的技术问题在于提供一种人工改造的脱氨酶辅助的dna中5-甲基胞嘧啶修饰单碱基分辨率定位分析方法，即一种能应用于dna修饰测序领域中，具有高灵敏度、高选择性且操作简便的单碱基分辨率的5mc定位测序方法。
6.本发明通过ea3c-1蛋白对dna中c进行脱氨基作用，直接测序获得5mc的单碱基分辨率定位信息。本发明提供的测序方案不需要对5mc进行转化及保护。
7.为实现上述目的，本发明提供的人工改造脱氨酶辅助的dna中5-甲基胞嘧啶修饰单碱基分辨率定位分析方法，其特征在于：包含如下步骤：
8.s1：wta3c和ea3c-1蛋白的表达及纯化；
9.s2：对待检dna进行变性及脱氨基处理：
10.先对dna进行变性处理使其形成单链，随后用人工改造的脱氨酶ea3c-1对单链dna进行脱氨基处理，再将反应体系中的脱氨基酶进行高温灭活处理，具体步骤为：
11.s2.1)dna变性处理是将dna在95℃高温下孵育10分钟后立即转入冰浴5分钟使双链dna变性成单链dna；
12.s2.2)所使用的脱氨基反应缓冲液中各成分的终浓度为20mm的4-羟乙基哌嗪乙磺酸，ph为5.5；
13.s2.3)脱氨基蛋白的用量需要根据实验过程中表达的脱氨酶蛋白的具体活性进行调整，以保证脱氨基蛋白的用量可以使反应体系中dna上的胞嘧啶充分脱氨基；脱氨基反应温度为33℃，反应时间为4小时；
14.s2.4)脱氨酶的高温灭活处理是在脱氨基反应结束后对反应体系进行90℃，10分钟的孵育，待反应温度冷却至室温可进行下一步操作；
15.s3：扩增脱氨后的dna片段：取上述40ng脱氨基样品进行聚合酶链式反应，对脱氨基的dna片段进行pcr扩增。
16.s4：特定序列的dna片段，经扩增后可以直接进行sanger测序；用人工改造的脱氨酶ea3c-1对单链dna进行脱氨基处理，以检测待检dna中处于不同序列特征中的5mc：
17.经ea3c-1处理的待检dna中的不同基序的c位点在测序中被读为t，而5mc位点在测序中被读为c。
18.本发明的技术原理如下：
19.见图1-2，改造的ea3c-1对不同基序的c进行脱氨基成为u，随后通过pcr扩增和测序读为t，而5mc能够抵抗ea3c-1的脱氨基作用，因此通过pcr扩增和测序均读为c。从而实现对所有位点的dna甲基化进行定位分析的目的。
20.本发明的优点及有益效果如下：
21.本发明提供的测序方案不依赖于亚硫酸氢盐处理且不涉及其他生物酶的辅助，相对于目前的主流方法而言，操作更简单快捷，更利于推广使用。具体为：
22.1、本发明中，方法操作简便，无需繁琐的样品前处理，脱氨基处理后可直接进行pcr扩增反应。
23.2、本发明无需亚硫酸氢盐处理以及随后的纯化处理。
24.3、本发明无需利用试剂氧化或衍生化试剂标记，极大的缩短了实验的时间。
25.4、本发明涉及的胞嘧啶脱氨酶对不同基序的胞嘧啶具有高效的脱氨效率(》
96％)，而对不同基序中的5mc的脱氨基效率较低(《10％)，有利于5mc的定位分析。
26.5、本发明无需采用昂贵的第三代测序平台，只需采用下一代测序平台技术即可完成5mc的单碱基分辨率定位分析。
27.6、本发明涉及的方法能够广泛应用于不同生物来源5mc修饰位点的研究，并有助于对5mc的生物学功能进行更加深入的研究。
附图说明
28.图1为本发明中ea3c-1对胞嘧啶及5-甲基胞嘧啶的脱氨基结构示意图。
29.图2为本发明中本发明中ea3c-1对胞嘧啶及5-甲基胞嘧啶的脱氨基定位示意图。
30.图3为本发明中人工合成的含有c的24寡核苷酸长度dna链脱氨基处理前后lc-ms/ms检测效果。
31.图4为本发明中人工合成的含有5mc的24寡核苷酸长度dna链脱氨基处理前后lc-ms/ms检测效果。
32.图5为本发明中人工合成的分别含有c和5mc的dna链(dna-dc,及dna-5mdc)经ea3c-1脱氨基处理前后测序效果对比图。
具体实施方式
33.下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进行地进一步说明。
34.实施例1：人工改造的胞嘧啶脱氨酶的筛选
35.本发明使用的野生型胞嘧啶脱氨酶wta3c的氨基酸序列参考美国国家生物技术信息中心(ncbi gene id:23350)，对其进行随机突变筛选对c的良好脱氨基能力但不能对5mc脱氨基的蛋白，最后得到ea3c-1蛋白。ea3c-1与wta3c相比仅有1处不同，从188位亲水氨基酸丝氨酸(s，wta3c)更改为疏水氨基酸异亮氨酸(i，ea3c-1)。
36.wta3c和ea3c-1蛋白分别表达于pet-41a(+)质粒载体，蛋白n端带有gst标签，c端带有8xhis标签，标签与a3c蛋白之间含有人鼻病毒3c蛋白酶(hrv 3c)识别位点，蛋白表达于大肠杆菌bl21(de3)plyss细胞。蛋白表达后采用谷胱甘肽琼脂糖珠进行纯化，经hrv3c酶切后，分别获得全长的a3c和ea3c-1脱氨酶。
37.实施例2：人工改造的胞嘧啶脱氨酶性质分析
38.具体步骤如下：
39.(1)首先配制工作溶液：将4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)溶解于去离子水中，浓度为200mm，并调节其ph至5.5。
40.(2)商品化合成的分别含有c及5mc的24寡核苷酸长度dna链。
41.(3)取步骤(2)中所得的变性dna样品60ng，分别加入一定量的ea3c-1(蛋白的用量需要根据实验过程中表达的脱氨酶蛋白的具体活性进行调整)，2μl步骤(1)配制的4-羟乙基哌嗪乙磺酸反应缓冲液(ph 5.5)，加去离子水至反应体系为20μl。在33℃下反应4个小时；反应结束后，将样品在95℃下孵育10分钟。
42.(4)随后对步骤(3)脱氨基的24寡核苷酸长度dna链进行酶解处理，酶解后的产物使用lc-ms/ms来分析检测。
43.结果见图3-4，含有c和5mc的24寡核苷酸长度dna链经ea3c-1处理前后的质谱图表
明，处理后c的质谱信号明显下降，可以认为ea3c-1能够有效的脱去c的氨基；而处理后5mc的质谱信号强度并未明显减少，故而可以认为ea3c-1具有较弱脱去处于5mc的氨基的能力。该数据证明，ea3c-1可以作为筛选胞嘧啶中5mc的脱氨酶。
44.实施例3:标准合成dna分析
45.商品化合成的分别含有c及5mc的dna链。分别取各dna 60ng，加入一定量的ea3c-1(根据所使用的ea3c-1的实际活性确定最合适的脱氨基浓度)，2μl 200mm hepes(ph 5.5)，加去离子水至反应体系为20μl，在33℃水浴中温育4个小时。随后在95℃水浴中温育10分钟。
46.取上述反应后的dna进行聚合酶链式扩增反应。反应体系：10
×
扩增缓冲液5μl，10μmol/l正反向引物各2μl，模板dna 5ng，hot start taq dna聚合酶用量10u，补加去离子水至体系为50μl。扩增反应的退火温度根据不同区域选出不同的退火温度；扩增循环时间程序：(1)95℃变性5min；(2)95℃变性30sec；(3)50-32℃退火30sec；(4)32℃延伸30sec；(2)-(4)步重复25次；32℃延伸10min，放置4℃进行贮存。样品进行桑格(sanger)测序。
47.结果见图5，ea3c-1可以将dna-dc中不同基序中的c基本完全脱氨基，在测序过程中读作t，但将dna-5mdc中处于tc和cc位点的5mc极少量脱氨基，在测序过程中绝大多数被读作c，同时不能使dna-5mdc中处于gc及ac位点的5mc脱氨基，在测序过程中读作c全部读作t。该结果表明ea3c-1可以对不同基序的5mc进行定位分析。

技术特征：

1.一种人工改造脱氨酶辅助的dna中5-甲基胞嘧啶修饰单碱基分辨率定位分析方法，其特征在于：包含如下步骤：s1：wta3c和ea3c-1蛋白的表达及纯化；s2：对待检dna进行变性及脱氨基处理：先对dna进行变性处理使其形成单链，随后用人工改造的脱氨酶ea3c-1对单链dna进行脱氨基处理，再将反应体系中的脱氨基酶进行高温灭活处理，具体步骤为：s2.1)dna变性处理是将dna在95℃高温下孵育10分钟后立即转入冰浴5分钟使双链dna变性成单链dna；s2.2)所使用的脱氨基反应缓冲液中各成分的终浓度为20mm的4-羟乙基哌嗪乙磺酸，ph为5.5；s2.3)脱氨基蛋白的用量需要根据实验过程中表达的脱氨酶蛋白的具体活性进行调整，以保证脱氨基蛋白的用量可以使反应体系中dna上的胞嘧啶充分脱氨基；脱氨基反应温度为33℃，反应时间为4小时；s2.4)脱氨酶的高温灭活处理是在脱氨基反应结束后对反应体系进行90℃，10分钟的孵育，待反应温度冷却至室温可进行下一步操作；s3：扩增脱氨后的dna片段：取上述40ng脱氨基样品进行聚合酶链式反应，对脱氨基的dna片段进行扩增；s4：特定序列的dna片段，经扩增后可以直接进行sanger测序；经ea3c-1处理的待检dna中的不同基序的c位点在测序中被读为t，而5mc位点在测序中被读为c。

技术总结

本发明公开了一种人工改造脱氨酶辅助的DNA中5-甲基胞嘧啶修饰单碱基分辨率定位分析方法。本发明利用人工改造的胞嘧啶脱氨酶eA3C-1蛋白对DNA中不同序列特征的胞嘧啶可以实现有效的脱氨基，而其对不同序列特征的5-甲基胞嘧啶不脱氨基的策略，随后进行聚合酶链式反应扩增进而测序获得5-甲基胞嘧啶的位点信息。该方法灵敏度高、选择性高、操作简便，不涉及亚硫酸氢盐处理且无需其他生物酶介导，可以直接获得DNA中5-甲基胞嘧啶的单碱基分辨率定位。位。位。