一种基于催化发夹自组装反应的miRNA检测探针及其应用

一种基于催化发夹自组装反应的mirna检测探针及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种基于催化发夹自组装反应的mirna检测探针及其应用。

背景技术：

2.microrna(mirna)是一类18-25个核苷酸长的非编码小单链rna分子。异常的mirna表达与多种人类疾病有关，如恶性肿瘤、炎症性疾病、肾脏疾病和心血管疾病。然而，mirnas检测仍然是临床应用中的一大挑战，因为它简单、快速、成本低、灵敏度高、特异性强。传统的mirna检测方法包括northern印迹法、微阵列分析和逆转录酶定量聚合酶链反应(rt-qpcr)。然而，这些方法中的每一种都有其自身的局限性。
3.催化发夹组装(catalytic hairpin assembly,下称cha)反应是一种等温、无酶的信号放大技术，它依赖于热力学驱动的熵增益过程。与rt-qpcr相比，cha反应是等温的，无需昂贵的复杂热循环设备。此外，与其他酶辅助等温扩增方法，如滚环扩增(rca)、链置换扩增(sda)、环介导等温扩增(lamp)相比，cha反应无需酶的参与，这大大降低了酶的成本并消除了对储存和运输冷链的需求。目前，鉴于cha的优势，一些基于cha的检测方法已经建立起来，用于mirna的定量检测。然而，迄今为止使用这些基于cha的mirna检测方法的检测极限并不令人满意，通常在纳摩尔(nm)到皮摩尔(pm)的范围内。然而，任何单个mirna的血浆浓度都以飞摩尔(fm)浓度甚至更低的水平。因此，提高基于cha的检测方法的灵敏度非常重要。cha的背景泄漏，即在没有引发剂序列的情况下发夹探针h1和h2之间的自发响应，导致高背景信号，从而降低信噪比，是限制其检测的主要原因灵敏度。

技术实现要素：

4.针对现有技术的不足，本发明提出了一种基于催化发夹自组装反应的mirna检测探针及其应用。
5.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
6.第一方面，本发明提出了一种核酸检测探针，包括脱氧核苷酸三磷酸、发夹探针h1与发夹探针h2。
7.其中，所述的脱氧核苷酸三磷酸用于阻断或封闭由于dna呼吸而暴露的碱基位点。
8.第二方面，本发明提出了一种核酸检测试剂盒，包括上述的探针以及荧光侧向流试纸条。
9.第三方面，本发明提出了dntp作为dna呼吸作用暴露位点的封闭剂在制备核酸检测产品中的应用。
10.本发明的有益效果：
11.本发明改良的cha(下称dntps-cha)通过加入脱氧核苷酸三磷酸(dntp,deoxy-ribonucleoside triphosphate)而显着降低cha的背景信号，阻断由于dna呼吸而暴露的碱基位点，从而显着减少两个发夹dna探针h1和h2之间的自发反应，显著降低cha反应的背景
泄露，从而提高基于cha检测的检测灵敏度。
附图说明
12.下面结合附图对本发明作进一步的说明。
13.图1本发明的示例中的用于检测mirna-21的发夹型dna探针的设计及cha反应原理。
14.图2本发明的示例中的非还原性聚丙烯酰胺凝胶电泳与荧光-猝灭实验验证cha反应的可行性。
15.图3本发明的示例中的cha反应中加入dntps对背景泄露的影响。
16.图4比较现有的cha(pure-cha)与本发明的改良型cha(dntps-cha)联合荧光侧向流层析试纸条对血清mirna-21的检测灵敏度。
具体实施方式
17.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
18.在本发明的一些示例中，以mirna-21的检测为例，构建了一组发夹型dna探针。如图1所示，根据mirna-21的序列，通过nupack软件设计一组具有发夹型的dna探针(简写为h1和h2)。发夹型的dna探针h1可被mirna-21打开，而打开后的h1又可进一步将h2打开，并与h2形成dna双链，同时释放mirna-21。后者将进入下一轮反应，继续促发h1和h2形成dna双链，其序列如下：
19.表1：mirna-21序列及发夹型dna探针的序列
[0020][0021]
上述的探针均由生物工程生工生物工程(上海)股份有限公司合成、纯化。将所制备的探针分别用tae/mg2+缓冲液溶解至1μm/l后，进行退火处理，让各探针保持发夹结构，退火温度为：从95℃以1℃/min的速度缓慢降温至25℃。退火处理后，于负20摄氏度冰箱放置备用。
[0022]
本发明的一些示例中，提供了dna探针用于检测mirna-21的可行性分析，具体包括以下步骤。
[0023]
1.非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(native-page)验证cha反应的可行性
[0024]
配制12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，退火处理后的探针h1和h2及mirna-21均稀释成3μm/l的浓度。分别配置以下电泳样品：
①
1μm h1；
②
1μm h2；
③
1μm mirna-21；
④
1μm h1+h2；
⑤
1μm h1+h2+mirna-21；上述样品混合后在30℃水浴30分钟；加入5μl 6
×
上样缓冲液混合，取15μl混合液上样，在120v电压下电泳60分钟，电泳凝胶用eb染10分钟，通过凝胶成像仪成像。如图2a所示，第4条泳道表明，在mirna-21不存在时，所设计的两个探针h1和h2有微弱自发结合，第5条泳道表明，探针h1和h2可在mirna-21的促发下，形成dna双链。
[0025]
2.荧光-猝灭实验检测验证cha反应的可行性
[0026]
分别在探针h2的5’端与3’端标记荧光素(fam)和猝灭基团(bhq1)，当探针h2形成发夹型时，荧光基团可被猝灭基团猝灭。一旦cha反应被促发，h1能够将h2打开,从而使h2标记的fam发出荧光信号。为此，分别用荧光光谱仪检测1μm的h1+h2及1μm h1+h2+mirna的荧光信号。如图2b所示，当反应体系中只有h1和h2时，仅能检测到微弱的荧光信号，一旦应体系中加入mirna-21，荧光信号明显增强。结果提示，mirna-21可促发h1和h2发生cha反应。
[0027]
如图3a所示，所设计的发夹型dna探针可因为dna呼吸作用，因此暴露出应封闭在发夹内部的碱基位点。当h1和h2均发生dna呼吸作用时，可促发两个发夹探针形成dna双链，由此形成cha的背景泄露。本发明的一些示例中，提出一种利用脱氧核糖核苷三磷酸(dntps)作为封闭剂的方法，在cha反应体系中加入dntps。dntps可与dna探针因呼吸作用而暴露出的碱基位点结合，而抑制h1和h2发生自组装反应，从而降低cha的背景泄露。本研究中，称这种低背景泄露的改良型cha反应为dntps-cha。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果提示，在cha中的h1和h2混合物(浓度均为1μm)中，在100nt处可以看到h1-h2杂合双链体的特定条带，尽管不是很明显。然而，在dntps-cha系统中没有观察到这个100nt条带，这表明当将dntps添加到反应系统中时，h1和h2之间的自发反应被大大抑制(图3b和图3c)。荧光-猝灭实验同样也提示dntps-cha可显著降低h1和h2之间的自发反应，如图3d所示，dntps-cha的反应速率比纯cha慢得多。dntps-cha达到平台期所需的时间更长，达到平台期超过45分钟，而纯cha在约15分钟时达到平台期。值得注意的是，dntps-cha中h1和h2的自发反应也比纯cha弱得多。图3e显示了六次独立实验在60分钟时的平均荧光值。dntps-cha中h1+h2+mirna-21和h1+h2的平均荧光值显着低于纯-cha，p《0.0001。随后，我们计算了两种方法的平均信噪比(s/n)。dntps-cha和纯-cha的平均s/n分别为9.66和4.29，p《0.0001。
[0028]
在本发明的另一些实施例中，验证了dntps-cha联合荧光侧向流层析试纸条(lfa)对血清mirna-21的检测灵敏度。为检测dntps-cha-lfa的检出限，将mirna-21用胎牛血清稀释成不同浓度，用dntps-cha-lfa和cha-fla进行检测。对于cha-lfa方法，首先将h1探针，h2探针按400nm：400nm的浓度1：1混合，配制成探针混合液。对于dntps-fla方法，将h1探针，h2探针与dntps混合，三者的浓度为(600nm：600nm：10μm)，制备成检测探针混合液。上述探针混合液需在1h内使用。分别取50μl待测标本，与上述探针混合物按1：1体积充分混匀；至于30℃水浴锅中，水浴反应30分钟；水浴后，取70μl上述反应液分别滴加在荧光侧向流试纸条，室温下静置2分钟后，将分析试纸条插入荧光检测仪，读取检测线和质控线的荧光值。结果如图4所示，荧光值随着dntps-cha-lfa和cha-fla中mirna-21浓度的降低而降低。cha-fla(图4a)的阴性对照平均荧光值为2283
±
341，而dntps-cha-fla(图4b)的平均荧光值为616
±
149。我们根据阴性结果的荧光值的均值+3
×
标准差作为截断值。对于纯-cha-fla，截止值可以计算为3306，而dntps-cha-lfa的截止值为1063。因此，cha-fla方法的检测限为1pm。而dntps-cha-fla方法的检测极限达到了100am。绘制标准曲线并根据标准曲线确定样品浓度，如图4c和4d所示。结果表明，cha-fla(r2＝0.8468)和dntps-cha-fla(r2＝0.8309)均获得了良好的线性关系。
[0029]
需要注意的是，虽然上述的本发明的示例中，选用了mirna-21作为示例实施了本发明的检测探针及检测方法，但是本领域技术人员应当能够理解，本发明提出dntps作为dna呼吸作用暴露位点的封闭剂，对于mirna检测具有普适性。
[0030]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0031]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

技术特征：

1.一种mirna检测探针，包括：脱氧核苷酸三磷酸、发夹探针h1与发夹探针h2；其中，所述的脱氧核苷酸三磷酸用于阻断或封闭由于dna呼吸而暴露的碱基位点。2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，所述的发夹探针h1的3’端用修饰；所述的发夹探针h2的3’端用生物素修饰。3.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，所述脱氧核苷酸三磷酸包括datp、dgtp、dctp、和dttp。4.一种mirna检测试剂盒，包括权利要求1～3任一所述的探针以及荧光侧向流试纸条。5.根据权利要求4所述的mirna检测试剂盒，其特征在于，所述荧光侧向流试纸条包括：底板以及依次粘附在所述底板上相互交错排列的样品垫、结合垫、包被膜和吸收垫。6.根据权利要求4所述的mirna检测试剂盒，其特征在于，所述结合垫上有荧光素、亲和素双修饰的聚乙烯微球。7.根据权利要求4所述的mirna检测试剂盒，其特征在于，所述的探针为权利要求2所述的探针，所述包被膜上的检测线是通过固定抗抗体制备，包被膜上的质控线为固定的生物素。8.dntp作为dna呼吸作用暴露位点的封闭剂在制备核酸检测产品中的应用。9.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，用于检测mirna-21，所述的发夹探针h1与发夹探针h2的序列分别为：tcaacatcagtctgataagctagatgttgaagtgaggtagcttatcagact；taagctacctcacttcaacatctagcttatcagactgatgttgaagtgagg。

技术总结

本发明公开了一种基于催化发夹自组装反应的miRNA检测探针及其应用，属于生物检测技术领域。本发明公开了一种可显著降低催化发夹自组装(catalytic hairpin assembly，CHA)反应的背景泄露的方法，并利用这种改良版CHA信号放大系统联合荧光侧向流试纸条，实现快速、高灵敏度检测血清等体液样本中的miRNA。本发明提供的检测方法，可实现在60分钟内完成样品的检测，且操作简单无需复杂的PCR扩增，能够实现miRNA的即时诊断。现miRNA的即时诊断。现miRNA的即时诊断。