一种利用改良CTAB法提取铁皮石斛茎基因组DNA的方法与流程

一种利用改良ctab法提取铁皮石斛茎基因组dna的方法
技术领域
1.本发明涉及ctab法提取植物基因组dna技术领域，具体是指一种利用改良ctab法提取铁皮石斛茎基因组dna的方法。

背景技术：

2.随着现代分子生物学的飞速发展，dna多态性遗传标记，个体基因差异等方法已广泛应用于分子育种及克隆研究等领域，而简便实用的dna提取方法是开展上述研究工作的重要前提。传统方法中在提取铁皮石斛茎基因组dna时采取有毒试剂β-巯基乙醇，实验的安全性较低，操作过程中采取的简单步骤使得提取出的dna的质量不高，为了有效提高实验的安全性和dna提取的质量，需要进行改进。

技术实现要素：

3.以解决上述背景技术中提出的问题，本发明的目的在于提供一种利用改良ctab法提取铁皮石斛茎基因组dna的方法，大大提高了实验的安全性，有效稳定渗透压，并优化细胞裂解液的配方，更好地去除蛋白质，提取的dna质量较好。
4.为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种利用改良ctab法提取铁皮石斛茎基因组dna的方法，具体包括以下步骤：
5.(1)材料研磨：
6.取200mg铁皮石斛茎置于提前预冷的研钵中研磨成粉末，将研磨后的粉末转移到2.0ml的离心管中；
7.(2)去多糖处理：
8.a.加入1.2ml的溶液a和65μl的1mol/l dtt，上下颠倒混匀，若粉末不能均匀分散，用涡旋仪适当震荡；
9.b.将离心管置于65℃中水浴15min，期间上下颠倒离心管一次，4℃下10000g离心10min，弃上清液；
10.c.再加1.2ml的洗液，置于65℃中水浴15min，4℃下10000g离心10min，弃上清；
11.d.如果上清液仍旧粘稠，则再重复步骤(2)中的c步骤；
12.(3)提取液萃取：
13.在步骤(2)所得沉淀中加入于65℃水浴预热后的溶液b 1000ul、100μl的2％ sds，50ul的2％pvp-40t，和65μl的1mol/l dtt，然后置于65℃水浴1h，期间每15min上下颠倒混匀，水浴结束后，于室温下10000g离心10min，吸取上清液至新的2.0ml离心管；
14.(4)dna抽提：
15.a.在步骤(3)中所获得的上清液中加入等体积的溶液c，放入旋转混合仪中混匀10min，静置2min，于10000g室温离心10min，转移上清至新的2.0ml的离心管；
16.b.在步骤(4)中a步骤所得的上清液中加入等体积的溶液d，放入旋转混合仪中混匀10min，静置2min，于10000g室温离心10min，转移上清至新的1.5ml的离心管；
17.(5)dna沉淀：
18.在步骤(4)中b步骤所获得的上清液中加入预冷后的2/3体积的无水乙醇和1/10体积的3m醋酸钠，上下颠倒混匀，并置于-20℃中沉淀30min后，于4℃下10000g离心10min，倒掉上清液获得dna沉淀；
19.(6)dna沉淀的洗涤和溶解：
20.a.第一次洗涤dna沉淀，在步骤(5)中多得的dna沉淀中加入预冷的75％的乙醇，轻弹离心管底部，使dna沉淀重悬，于4℃下12000rpm离心2min，倒掉上清液；
21.b.第二次洗涤dna沉淀，在步骤(6)中a步骤所得的dna沉淀中加入预冷的75％的乙醇，轻弹离心管底部，使dna沉淀重悬，于4℃下12000rpm离心2min，倒掉上清液，将离心管置于真空浓缩仪中，在d-hv模式下运行15min，控干离心管中的水分；
22.c.往晾干后的dna沉淀中加入已在60℃下预热的100ul ddh2，置于4℃下溶解得dna溶液，最终于-20℃下长期保存。
23.进一步的，所述的溶液a的组分为0.1mol/l ph8.0 tris-hcl、5mmol/l edta、0.35mol/l sorbitol。
24.进一步的，所述的溶液b的组分为0.1mol/l ph8.0 tris-hcl、1.4mol/l nacl、20mol/l edta、2％ ctab。
25.进一步的，所述的溶液c的组分为酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)的混合物。
26.进一步的，所述的溶液d的组分为氯仿:异戊醇(24:1)的混合物。
27.本发明的有益效果是：本发明以dtt代替传统方法中的有毒试剂β-巯基乙醇，大大提高了实验的安全性，在ctab裂解细胞前，先用溶液a进行数次的去多糖处理，能有效地提高后续dna提取的质量，同时在溶液a中加入sorbitol，能有效稳定渗透压，并优化细胞裂解液的配方，加入适量的pvp为了多酚的去除，加入sds为了更好地去除蛋白质，最终使得dna质量好，可直接应用于下游的分子生物学实验。
附图说明
28.图1为本发明方法提取dna的琼脂糖凝胶电泳图。(其中1、2泳道为打样机打样的铁皮石斛茎，3、4泳道为研磨的钩状石斛茎，5、6泳道为研磨的美花石斛茎，7、8泳道为研磨的滇金石斛茎，9、10泳道为研磨的铁皮石斛茎。)
具体实施方式
29.下面用具体实施例说明本发明，并不是对本发明的限制。
30.实施例一
31.(1)材料研磨：
32.取200mg铁皮石斛茎剪碎置于已装有钢珠的2.0ml离心管中，将离心管放入打样机中处理2min；
33.(2)去多糖处理：
34.a.加入1.2ml的溶液a和65μl的1mol/l dtt，上下颠倒混匀，若粉末不能均匀分散，用涡旋仪适当震荡；
35.b.将离心管置于65℃中水浴15min，期间上下颠倒离心管一次，4℃下10000g离心
10min，弃上清液；
36.c.再加1.2ml的洗液，置于65℃中水浴15min，4℃下10000g离心10min，弃上清；
37.d.如果上清液仍旧粘稠，则再重复步骤(2)中的c步骤；
38.(3)提取液萃取：
39.在步骤(2)所得沉淀中加入于65℃水浴预热后的溶液b 1000ul、100μl的2％ sds，50ul的2％pvp-40t，和65μl的1mol/l dtt，然后置于65℃水浴1h，期间每15min上下颠倒混匀，水浴结束后，于室温下10000g离心10min，吸取上清液至新的2.0ml离心管；
40.(4)dna抽提：
41.a.在步骤(3)中所获得的上清液中加入等体积的溶液c，放入旋转混合仪中混匀10min，静置2min，于10000g室温离心10min，转移上清至新的2.0ml的离心管；
42.b.在步骤(4)中a步骤所得的上清液中加入等体积的溶液d，放入旋转混合仪中混匀10min，静置2min，于10000g室温离心10min，转移上清至新的1.5ml的离心管；
43.(5)dna沉淀：
44.在步骤(4)中b步骤所获得的上清液中加入预冷后的2/3体积的无水乙醇和1/10体积的3m醋酸钠，上下颠倒混匀，并置于-20℃中沉淀30min后，于4℃下10000g离心10min，倒掉上清液获得dna沉淀；
45.(6)dna沉淀的洗涤和溶解：
46.a.第一次洗涤dna沉淀，在步骤(5)中多得的dna沉淀中加入预冷的75％的乙醇，轻弹离心管底部，使dna沉淀重悬，于4℃下12000rpm离心2min，倒掉上清液；
47.b.第二次洗涤dna沉淀，在步骤(6)中a步骤所得的dna沉淀中加入预冷的75％的乙醇，轻弹离心管底部，使dna沉淀重悬，于4℃下12000rpm离心2min，倒掉上清液，将离心管置于真空浓缩仪中，在d-hv模式下运行15min，控干离心管中的水分；
48.c.往晾干后的dna沉淀中加入已在60℃下预热的100ul ddh2，置于4℃下溶解得dna溶液，最终于-20℃下长期保存。
49.实施例二
50.(1)材料研磨：
51.取200mg钩状石斛茎置于提前预冷的研钵中研磨成粉末，将研磨后的粉末转移到2.0ml的离心管中；
52.(2)去多糖处理：
53.a.加入1.2ml的溶液a和65μl的1mol/l dtt，上下颠倒混匀，若粉末不能均匀分散，用涡旋仪适当震荡；
54.b.将离心管置于65℃中水浴15min，期间上下颠倒离心管一次，4℃下10000g离心10min，弃上清液；
55.c.再加1.2ml的洗液，置于65℃中水浴15min，4℃下10000g离心10min，弃上清；
56.d.如果上清液仍旧粘稠，则再重复步骤(2)中的c步骤；
57.(3)提取液萃取：
58.在步骤(2)所得沉淀中加入于65℃水浴预热后的溶液b 1000ul、100μl的2％ sds，50ul的2％pvp-40t，和65μl的1mol/l dtt，然后置于65℃水浴1h，期间每15min上下颠倒混匀，水浴结束后，于室温下10000g离心10min，吸取上清液至新的2.0ml离心管；
59.(4)dna抽提：
60.a.在步骤(3)中所获得的上清液中加入等体积的溶液c，放入旋转混合仪中混匀10min，静置2min，于10000g室温离心10min，转移上清至新的2.0ml的离心管；
61.b.在步骤(4)中a步骤所得的上清液中加入等体积的溶液d，放入旋转混合仪中混匀10min，静置2min，于10000g室温离心10min，转移上清至新的1.5ml的离心管；
62.(5)dna沉淀：
63.在步骤(4)中b步骤所获得的上清液中加入预冷后的2/3体积的无水乙醇和1/10体积的3m醋酸钠，上下颠倒混匀，并置于-20℃中沉淀30min后，于4℃下10000g离心10min，倒掉上清液获得dna沉淀；
64.(6)dna沉淀的洗涤和溶解：
65.a.第一次洗涤dna沉淀，在步骤(5)中多得的dna沉淀中加入预冷的75％的乙醇，轻弹离心管底部，使dna沉淀重悬，于4℃下12000rpm离心2min，倒掉上清液；
66.b.第二次洗涤dna沉淀，在步骤(6)中a步骤所得的dna沉淀中加入预冷的75％的乙醇，轻弹离心管底部，使dna沉淀重悬，于4℃下12000rpm离心2min，倒掉上清液，将离心管置于真空浓缩仪中，在d-hv模式下运行15min，控干离心管中的水分；
67.c.往晾干后的dna沉淀中加入已在60℃下预热的100ul ddh2，置于4℃下溶解得dna溶液，最终于-20℃下长期保存。
68.实施例三
69.(1)材料研磨：
70.取200mg美化石斛茎置于提前预冷的研钵中研磨成粉末，将研磨后的粉末转移到2.0ml的离心管中；
71.(2)去多糖处理：
72.a.加入1.2ml的溶液a和65μl的1mol/l dtt，上下颠倒混匀，若粉末不能均匀分散，用涡旋仪适当震荡；
73.b.将离心管置于65℃中水浴15min，期间上下颠倒离心管一次，4℃下10000g离心10min，弃上清液；
74.c.再加1.2ml的洗液，置于65℃中水浴15min，4℃下10000g离心10min，弃上清；
75.d.如果上清液仍旧粘稠，则再重复步骤(2)中的c步骤；
76.(3)提取液萃取：
77.在步骤(2)所得沉淀中加入于65℃水浴预热后的溶液b 1000ul、100μl的2％ sds，50ul的2％pvp-40t，和65μl的1mol/l dtt，然后置于65℃水浴1h，期间每15min上下颠倒混匀，水浴结束后，于室温下10000g离心10min，吸取上清液至新的2.0ml离心管；
78.(4)dna抽提：
79.a.在步骤(3)中所获得的上清液中加入等体积的溶液c，放入旋转混合仪中混匀10min，静置2min，于10000g室温离心10min，转移上清至新的2.0ml的离心管；
80.b.在步骤(4)中a步骤所得的上清液中加入等体积的溶液d，放入旋转混合仪中混匀10min，静置2min，于10000g室温离心10min，转移上清至新的1.5ml的离心管；
81.(5)dna沉淀：
82.在步骤(4)中b步骤所获得的上清液中加入预冷后的2/3体积的无水乙醇和1/10体
积的3m醋酸钠，上下颠倒混匀，并置于-20℃中沉淀30min后，于4℃下10000g离心10min，倒掉上清液获得dna沉淀；
83.(6)dna沉淀的洗涤和溶解：
84.a.第一次洗涤dna沉淀，在步骤(5)中多得的dna沉淀中加入预冷的75％的乙醇，轻弹离心管底部，使dna沉淀重悬，于4℃下12000rpm离心2min，倒掉上清液；
85.b.第二次洗涤dna沉淀，在步骤(6)中a步骤所得的dna沉淀中加入预冷的75％的乙醇，轻弹离心管底部，使dna沉淀重悬，于4℃下12000rpm离心2min，倒掉上清液，将离心管置于真空浓缩仪中，在d-hv模式下运行15min，控干离心管中的水分；
86.c.往晾干后的dna沉淀中加入已在60℃下预热的100ul ddh2，置于4℃下溶解得dna溶液，最终于-20℃下长期保存。
87.实施例四
88.(1)材料研磨：
89.取200mg滇金石斛茎置于提前预冷的研钵中研磨成粉末，将研磨后的粉末转移到2.0ml的离心管中；
90.(2)去多糖处理：
91.a.加入1.2ml的溶液a和65μl的1mol/l dtt，上下颠倒混匀，若粉末不能均匀分散，用涡旋仪适当震荡；
92.b.将离心管置于65℃中水浴15min，期间上下颠倒离心管一次，4℃下10000g离心10min，弃上清液；
93.c.再加1.2ml的洗液，置于65℃中水浴15min，4℃下10000g离心10min，弃上清；
94.d.如果上清液仍旧粘稠，则再重复步骤(2)中的c步骤；
95.(3)提取液萃取：
96.在步骤(2)所得沉淀中加入于65℃水浴预热后的溶液b 1000ul、100μl的2％ sds，50ul的2％pvp-40t，和65μl的1mol/l dtt，然后置于65℃水浴1h，期间每15min上下颠倒混匀，水浴结束后，于室温下10000g离心10min，吸取上清液至新的2.0ml离心管；
97.(4)dna抽提：
98.a.在步骤(3)中所获得的上清液中加入等体积的溶液c，放入旋转混合仪中混匀10min，静置2min，于10000g室温离心10min，转移上清至新的2.0ml的离心管；
99.b.在步骤(4)中a步骤所得的上清液中加入等体积的溶液d，放入旋转混合仪中混匀10min，静置2min，于10000g室温离心10min，转移上清至新的1.5ml的离心管；
100.(5)dna沉淀：
101.在步骤(4)中b步骤所获得的上清液中加入预冷后的2/3体积的无水乙醇和1/10体积的3m醋酸钠，上下颠倒混匀，并置于-20℃中沉淀30min后，于4℃下10000g离心10min，倒掉上清液获得dna沉淀；
102.(6)dna沉淀的洗涤和溶解：
103.a.第一次洗涤dna沉淀，在步骤(5)中多得的dna沉淀中加入预冷的75％的乙醇，轻弹离心管底部，使dna沉淀重悬，于4℃下12000rpm离心2min，倒掉上清液；
104.b.第二次洗涤dna沉淀，在步骤(6)中a步骤所得的dna沉淀中加入预冷的75％的乙醇，轻弹离心管底部，使dna沉淀重悬，于4℃下12000rpm离心2min，倒掉上清液，将离心管置
于真空浓缩仪中，在d-hv模式下运行15min，控干离心管中的水分；
105.c.往晾干后的dna沉淀中加入已在60℃下预热的100ul ddh2，置于4℃下溶解得dna溶液，最终于-20℃下长期保存。
106.实施例五
107.(1)材料研磨：
108.取200mg铁皮石斛茎置于提前预冷的研钵中研磨成粉末，将研磨后的粉末转移到2.0ml的离心管中；
109.(2)去多糖处理：
110.a.加入1.2ml的溶液a和65μl的1mol/l dtt，上下颠倒混匀，若粉末不能均匀分散，用涡旋仪适当震荡；
111.b.将离心管置于65℃中水浴15min，期间上下颠倒离心管一次，4℃下10000g离心10min，弃上清液；
112.c.再加1.2ml的洗液，置于65℃中水浴15min，4℃下10000g离心10min，弃上清；
113.d.如果上清液仍旧粘稠，则再重复步骤(2)中的c步骤；
114.(3)提取液萃取：
115.在步骤(2)所得沉淀中加入于65℃水浴预热后的溶液b 1000ul、100μl的2％ sds，50ul的2％pvp-40t，和65μl的1mol/l dtt，然后置于65℃水浴1h，期间每15min上下颠倒混匀，水浴结束后，于室温下10000g离心10min，吸取上清液至新的2.0ml离心管；
116.(4)dna抽提：
117.a.在步骤(3)中所获得的上清液中加入等体积的溶液c，放入旋转混合仪中混匀10min，静置2min，于10000g室温离心10min，转移上清至新的2.0ml的离心管；
118.b.在步骤(4)中a步骤所得的上清液中加入等体积的溶液d，放入旋转混合仪中混匀10min，静置2min，于10000g室温离心10min，转移上清至新的1.5ml的离心管；
119.(5)dna沉淀：
120.在步骤(4)中b步骤所获得的上清液中加入预冷后的2/3体积的无水乙醇和1/10体积的3m醋酸钠，上下颠倒混匀，并置于-20℃中沉淀30min后，于4℃下10000g离心10min，倒掉上清液获得dna沉淀；
121.(6)dna沉淀的洗涤和溶解：
122.a.第一次洗涤dna沉淀，在步骤(5)中多得的dna沉淀中加入预冷的75％的乙醇，轻弹离心管底部，使dna沉淀重悬，于4℃下12000rpm离心2min，倒掉上清液；
123.b.第二次洗涤dna沉淀，在步骤(6)中a步骤所得的dna沉淀中加入预冷的75％的乙醇，轻弹离心管底部，使dna沉淀重悬，于4℃下12000rpm离心2min，倒掉上清液，将离心管置于真空浓缩仪中，在d-hv模式下运行15min，控干离心管中的水分；
124.c.往晾干后的dna沉淀中加入已在60℃下预热的100ul ddh2，置于4℃下溶解得dna溶液，最终于-20℃下长期保存。
125.实施例1-5的提取结果见图1。从图1可以看出，以本发明实施的方法提取铁皮石斛茎dna的凝胶电泳成像检测，本发明的方法提取获得的石斛茎基因组dna条带清晰可见，单一明亮，无弥散现象，表明样品dna完整性好。同时，本方法对提取美花石斛茎、滇金石斛茎dna都有较好的效果。
126.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.一种利用改良ctab法提取铁皮石斛茎基因组dna的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：(1)材料研磨：取200mg铁皮石斛茎置于提前预冷的研钵中研磨成粉末，将研磨后的粉末转移到2.0ml的离心管中；(2)去多糖处理：a.加入1.2ml的溶液a和65μl的1mol/l dtt，上下颠倒混匀，若粉末不能均匀分散，用涡旋仪适当震荡；b.将离心管置于65℃中水浴15min，期间上下颠倒离心管一次，4℃下10000g离心10min，弃上清液；c.再加1.2ml的洗液，置于65℃中水浴15min，4℃下10000g离心10min，弃上清；d.如果上清液仍旧粘稠，则再重复步骤(2)中的c步骤；(3)提取液萃取：在步骤(2)所得沉淀中加入于65℃水浴预热后的溶液b 1000ul、100μl的2％sds，50ul的2％pvp-40t，和65μl的1mol/l dtt，然后置于65℃水浴1h，期间每15min上下颠倒混匀，水浴结束后，于室温下10000g离心10min，吸取上清液至新的2.0ml离心管；(4)dna抽提：a.在步骤(3)中所获得的上清液中加入等体积的溶液c，放入旋转混合仪中混匀10min，静置2min，于10000g室温离心10min，转移上清至新的2.0ml的离心管；b.在步骤(4)中a步骤所得的上清液中加入等体积的溶液d，放入旋转混合仪中混匀10min，静置2min，于10000g室温离心10min，转移上清至新的1.5ml的离心管；(5)dna沉淀：在步骤(4)中b步骤所获得的上清液中加入预冷后的2/3体积的无水乙醇和1/10体积的3m醋酸钠，上下颠倒混匀，并置于-20℃中沉淀30min后，于4℃下10000g离心10min，倒掉上清液获得dna沉淀；(6)dna沉淀的洗涤和溶解：a.第一次洗涤dna沉淀，在步骤(5)中多得的dna沉淀中加入预冷的75％的乙醇，轻弹离心管底部，使dna沉淀重悬，于4℃下12000rpm离心2min，倒掉上清液；b.第二次洗涤dna沉淀，在步骤(6)中a步骤所得的dna沉淀中加入预冷的75％的乙醇，轻弹离心管底部，使dna沉淀重悬，于4℃下12000rpm离心2min，倒掉上清液，将离心管置于真空浓缩仪中，在d-hv模式下运行15min，控干离心管中的水分；c.往晾干后的dna沉淀中加入已在60℃下预热的100ul ddh2，置于4℃下溶解得dna溶液，最终于-20℃下长期保存。2.根据权利要求1所述的一种利用改良ctab法提取铁皮石斛茎基因组dna的方法，其特征在于：所述的溶液a的组分为0.1mol/l ph8.0 tris-hcl、5mmol/l edta、0.35mol/l sorbitol。3.根据权利要求1所述的一种利用改良ctab法提取铁皮石斛茎基因组dna的方法，其特征在于：所述的溶液b的组分为0.1mol/l ph8.0 tris-hcl、1.4mol/l nacl、20mol/l edta、2％ctab。
4.根据权利要求1所述的一种利用改良ctab法提取铁皮石斛茎基因组dna的方法，其特征在于：所述的溶液c的组分为酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)的混合物。5.根据权利要求1所述的一种利用改良ctab法提取铁皮石斛茎基因组dna的方法，其特征在于：所述的溶液d的组分为氯仿:异戊醇(24:1)的混合物。

技术总结

本发明涉及CTAB法提取植物基因组DNA技术领域，具体是指一种利用改良CTAB法提取铁皮石斛茎基因组DNA的方法，具体包括以下步骤：(1)材料研磨：取200mg铁皮石斛茎置于提前预冷的研钵中研磨成粉末，将研磨后的粉末转移到2.0ml的离心管中；(2)去多糖处理；(3)提取液萃取；(4)DNA抽提；(5)DNA沉淀；(6)DNA沉淀的洗涤和溶解。本发明的有益效果是：以DTT代替有毒试剂β-巯基乙醇，大大提高了实验的安全性，在CTAB裂解细胞前，先用溶液A进行数次的去多糖处理，能有效地提高后续DNA提取的质量，同时在溶液A中加入Sorbitol，能有效稳定渗透压，并优化细胞裂解液的配方，加入适量的PVP为了多酚的去除，加入SDS为了更好地去除蛋白质，最终使得DNA质量好。得DNA质量好。得DNA质量好。