甲、乙型流感病毒和腺病毒核酸检测试剂盒及使用方法与流程

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种甲、乙型流感病毒和腺病毒核酸检测试剂盒及使用方法，可用于甲型流感病毒rna、乙型流感病毒rna和腺病毒dna的同时检测。

背景技术：

2.流感病毒是一种rna病毒，属于正黏病毒科，在流感病毒的表面覆盖有一层脂质包膜，脂质包膜上的糖蛋白突起由血凝素(hemagglutinin，h)和神经氨酸酶(neuraminidase，n)构成，根据流感病毒核蛋白与基质蛋白抗原性的不同，可将流感病毒分为甲、乙、丙三型。
3.其中，甲型流感病毒(influenzaavirus)最易发生变异，流感大流行往往是由于甲型流感病毒新亚型或旧亚型重现引起的。根据h和n抗原的不同，甲型流感病毒可分为许多亚型，例如h1n1、h2n2、h3n2主要感染人类，其它许多亚型的自然宿主多为禽类，但是由于变异，目前在禽流感中也出现了能够直接感染人类的亚型，例如h5n1、h7n1、h7n2、h7n3、h7n7、h7n9、h9n2和h10n8，其中h1n1、h5n1和h7n9尤为值得关注。人类在被甲型流感病毒感染后，症状主要有高热、咳嗽、流涕和肌肉疼痛等，多数伴有严重的肺炎，严重者心、肾等多个脏器会发生衰竭甚至导致死亡，病死率较高。甲型流感病毒主要通过空气飞沫传播，其次是通过消化道、受损皮肤和眼结膜等多种间接途径传播，传播速度和广度与人口密度有关。甲型流感病毒对人类的威胁较大，曾多次引发世界性大流行，是目前重点监控的呼吸道病毒之一。
4.乙型流感病毒(influenzab virus)也是引起流感的一种主要病毒，人类在被乙型流感病毒感染后的症状与甲型流感病毒相似，但是乙型流感病毒常呈爆发式局限性流行，一般不会引起大流行，并且乙型流感病毒导致的病人住院率仅为甲型流感病毒的1/4左右，因此相对于甲型流感病毒而言，乙型流感病毒对人类的影响不大，但是在临床检验中，需要将其与甲型流感病毒区分开来进行鉴别诊断。
5.甲、乙型流感病毒的实验室检测方法通常包括：(1)抗原检测：主要有金标法、酶联免疫法和免疫层析法等，这种检测方法具有检测时间短、灵敏度和特异性较差的特点；(2)培养法：使用鸡胚或mdck细胞培养法，分离甲、乙型流感病毒，但是检测时间长、阳性率低，因此一般不在临床使用；(3)核酸检测：该方法是目前最重要的检测方法，当前主要使用的是国家流感中心设计的rt-pcr法。
6.腺病毒(adenovirus，即呼吸道腺病毒)是一种没有包膜的病毒，由252个壳粒呈20面体排列构成，壳粒中包含线状双链dna分子。目前发现的腺病毒有100多个血清型，其中腺病毒有52种，分为a、b、c、d、e和f六个亚。腺病毒对人体的眼睛、呼吸道、胃肠道、尿道、膀胱和肝脏等均会产生感染，已知腺病毒中1/3的血清型与人类疾病相关。同时，一种血清型可引起不同的临床疾病，不同血清型也可引起同一种疾病。腺病毒引起的呼吸道感染的典型症状是咳嗽、鼻塞和咽炎，同时伴有发热、寒战、头痛和肌肉疼痛等。腺病毒引起的症状通常难以与其他病毒引起的呼吸道感染相区别，一般包括以下4中不同的综合表现：(1)急性发热性咽喉炎：通常多发于婴儿和儿童，由c组腺病毒引起，多出现咳嗽、鼻塞、发热和咽喉部溃疡等症状；(2)眼结膜热：症状与急性发热性咽喉炎相似，常同时发生结膜炎，多由b组
腺病毒的3、7型所致；(3)急性呼吸道疾病：多出现咽炎、发热、咳嗽和全身不适等症状，多由腺病毒的4、7型引起，也可由3型引起；(4)肺炎：腺病毒肺炎约占儿童期肺炎的10％，多由腺病毒的3、7型引起；青年人的腺病毒肺炎中，病死率为8-10％。
7.腺病毒的实验室检测方法通常包括：(1)抗体检测：采取急性期和恢复期双份血清进行检测，恢复期血清抗体效价比急性期增长4倍或以上时，即可诊断；快速抗体检测可用elisa法或乳胶凝集试验；(2)病毒培养：采集患者咽喉、咽分泌物、粪便和尿液等样本，离心取上清液接种敏感细胞，孵育后观察cpe现象(即病变细胞呈葡萄串状聚集，有拉丝现象)；(3)抗原检测：通常包括免疫荧光和酶免疫分析，与细胞培养相比，免疫荧光的灵敏性提高了40-60％；其他抗原检测方法还包括免疫层析法和乳胶凝集法；另外，还可以用荧光标记的抗六邻体抗体与分离培养细胞作用来鉴定腺病毒，并进行血清型分型；(4)dna杂交或酶切等方法：用于鉴定分离培养的病毒；(5)pcr方法：用于腺病毒感染的诊断，并能检测所有血清型，且敏感性高。
8.由此可见，甲型流感病毒、乙型流感病毒和腺病毒引起的症状较难区分，需要对患者进行鉴别诊断后区别对待。上述检测方法，除了荧光定量技术之外，均存在灵敏度低、耗时长，检测结果易出现假阳性或假阴性等缺点，因此易导致误诊、漏诊。
9.荧光探针pcr方法是在反应体系中加入含荧光基团的探针，利用荧光信号实时监测整个pcr进程，并在最后通过荧光信号对未知模板进行分析的方法。荧光pcr方法简便、快捷，具有良好的检测敏感性和特异性，可用于诊断、疗效判断及流行病学调查，是目前病原感染检测的主要方法。然而当前的荧光探针pcr方法通常每次只能检测一种病原微生物，对于引起症状相似的需要鉴别诊断的甲型流感病毒、乙型流感病毒和腺病毒检测效果仍相对较低，并且检测灵敏度和特异性也较低，因此需要进一步提高。

技术实现要素：

10.本发明的目的在于能够同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒和腺病毒，提高临床鉴别诊断的能力，并在检测的同时提高检测灵敏度和特异性。
11.为了实现上述目的，本发明公开了一种甲、乙型流感病毒和腺病毒核酸检测试剂盒，根据甲型流感病毒、乙型流感病毒和腺病毒中各病原体核酸的保守区域进行设计，得到了分别针对甲型流感病毒的matrix protein基因、乙型流感病毒的matrix protein基因和腺病毒核酸的hexon protein基因的核酸检测试剂盒，包括如下引物和探针的组合：
[0012][0013]
进一步的，还包括用于内标的人actin基因检测的引物和探针，用于内标的人actin基因检测的引物的探针的序列分别为：
[0014]
人actin基因上游引物引物：5
’‑
gatcccagaggtgcatta-3’；
[0015]
人actin基因下游引物引物：5
’‑
agtcctccagatcctttg-3’；
[0016]
人actin基因探针序列：5
’‑
cy5-caagccagttaccatgaggaatcc-3’。
[0017]
其中，甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒和用于内标的人actin基因的引物包括上游引物和下游引物，上游引物和下游引物分别是一组长为16-23nt的碱基序列，tm值在57-64℃之间。
[0018]
甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒和用于内标的人actin基因的探针是一组5’端标分别记有fam、vic、rox和cy5的荧光基团的长度为16-24nt的碱基序列。
[0019]
为了提高引物针对不同变异的匹配度，在甲型流感病毒的上游引物序列中含有简并碱基“r”，“r”代表碱基“a”或“g”；在乙型流感病毒的探针序列中含有简并碱基“y”，“y”代表碱基“c”或“t”；在腺病毒的上游引物序列中含有简并碱基“y”，“y”代表“c”或“t”。
[0020]
甲型流感病毒的下游引物“cgtctacgctgcagtc”同时也是逆转录引物；乙型流感病毒的下游引物“ctttgccttctccatcttc”同时也是逆转录引物。
[0021]
为了提高探针的tm值，甲型流感病毒探针序列的3’端标记有mgb；乙型流感病毒探针序列的3’端也标记有mgb；腺病毒探针序列的3’端也标记有mgb。
[0022]
所有上下游引物以及探针序列的交叉二聚体(cross dimer)的δg小于5.1kcal/mol，优选的，δg小于4.7kcal/mol。
[0023]
使用实时荧光pcr技术同时检测多种病原体核酸时，除了每种病原体的引物探针要符合序列保守、g+c含量和tm值适中、引物探针之间交叉二聚体要少等这些引物探针设计的基本原则之外，还要保证所有的引物探针之间无干扰，因为出现干扰会导致pcr反应曲线不呈“s”形、扩增效率低、ct值延后、荧光强度低下，以及非特异性扩增等问题。对此，本发明中设计的联合诊断甲、乙型流感病毒和腺病毒的引物探针的原则为：(1)无论是引物之间、引物与探针之间，还是探针之间，均不能出现连续6个碱基完全配对；(2)无论是引物之间、探针之间，还是引物与探针之间出现的交叉二聚体(cross dimer)的δg值越小越好，最大不超过6kcal/mol；(3)引物之间或引物与探针之间的连续配对碱基不能出现在引物序列的
3’端；探针之间连续配对碱基出现在探针的中间或3’端对扩增效率影响不大。本发明选择甲、乙型流感病毒matrix protein基因、腺病毒hexon protein基因和人actin基因这些基因的高度保守区域作为模板，在上述引物探针设计原则指导下设计引物及探针。
[0024]
本发明设计的引物探针产生的交叉二聚体(cross dimer)的δg均小于4.7kcal/mol，远低于“最大不超过6kcal/mol”的设计要求。因此，本发明从引物探针序列上保证了引物探针之间产生的干扰最小，从而保证了联合诊断的检测灵敏度和特异性。
[0025]
由于每种引物的扩增效率除了与引物本身的tm值和序列有关外，还与引物的浓度有关。本发明给出了每个引物对的最佳浓度，保证了每对引物的最佳扩增效率。由于不同发光物质在同一环境下的荧光强度有所区别，本发明给出了各个探针的最佳条件，保证了每个探针的荧光物质均具有最佳的发光效率。
[0026]
其中，所述上游引物按0.1-0.5μm的浓度非等比例混合。优选的，甲型流感病毒上游引物的浓度为0.2μm，乙型流感病毒上游引物的浓度为0.15μm，腺病毒上游引物的浓度为0.2μm，人actin基因上游引物的浓度为0.15μm。
[0027]
其中，所述下游引物按0.1-0.5μm的浓度等比例混合。优选的，所述下游引物的浓度为0.15μm。
[0028]
其中，所述探针按0.1-0.5μm的浓度非等比例混合。优选的，所述探针浓度分别为甲型流感病毒探针的浓度为0.1μm、乙型流感病毒探针的浓度为0.2μm、腺病毒探针的浓度为0.1μm和内标探针的浓度为0.1μm。
[0029]
因此，从引物探针的序列和最佳浓度来看，本发明保证了无论是rna病原体(甲、乙型流感病毒)还是dna病原体(腺病毒)的扩增效率基本一致，每个病原体感染都能得到正确评估的目的；同时获得了在不影响检测灵敏度和特异性的前提下提高检测效率、降低检测成本的目的。
[0030]
为了实现提高检测灵敏度的目的，本发明的检测试剂盒中包括pcr增强剂。
[0031]
其中，所述pcr增强剂包括硫酸铵、β-环糊精、tween20和bsa中的一种或多种的混合物；优选的，所述pcr增强剂包括2-20mm的硫酸铵、0.1-3mm的β-环糊精、0.05-0.5％的tween20和100-400μg/ml的bsa；更优选的，所述pcr增强剂包括10mm的硫酸铵、0.5mm的β-环糊精、0.1％的tween20和200μg/ml的bsa。
[0032]
其中，硫酸铵能够减少引物和模板的错配，提高pcr反应的特异性，降低反应条件的要求；bsa具有抵抗血素、黑素等抑制作用，可以增加聚合酶的稳定性，减少史记载试管壁上的吸附；tween20能够抵抗痕量的强离子去污剂的抑制作用；β-环糊精具有提高fam、vic、rox和cy5等荧光物质荧光强度的作用；因此，本发明的pcr增强剂具有提高dna聚合酶5
’‑3’
外切酶活性、增加荧光物质荧光强度以及提高引物扩增效率的作用。在pcr增强剂的作用下，本发明可进一步提高检测灵敏度。
[0033]
为了提高检测检测特异性，并防止产物污染导致的假阳性，本发明的检测试剂盒还包括防污染酶混合液。
[0034]
其中所述防污染酶混合液包括dutp、ung酶、hotstar dna聚合酶、逆转录酶和rna酶抑制剂中的一种或多种的混合物。
[0035]
进一步的，所述防污染酶混合液包括100-300μm的dutp、0.05-0.5u/反应的ung酶、0.8-5u/反应的hotstar dna聚合酶、5-50u/反应的逆转录酶和5-50u/反应的rna酶抑制剂；
优选的，所述防污染酶混合液包括240μm的dutp、0.1u/反应的ung酶、2u/反应的hotstar dna聚合酶、20u/反应的逆转录酶和20u/反应的rna酶抑制剂。
[0036]
其中，防污染酶混合液中的dutp在pcr扩增过程中与dttp竞争渗入到pcr产物中；ung酶在50℃时能够专一地水解含dutp的pcr产物；
[0037]
rna扩增的第一步是逆转录酶在50℃时将rna逆转录为cdna，而在50℃时，hotstar dna聚合酶不发生作用，因此，防污染酶混合液在50℃时，逆转录rna的同时也能够将被污染的pcr产物水解，此时hotstar dna聚合酶不发生作用，rna酶抑制剂能够保证在50℃时rna不被rnase水解，这样既保证了扩增的特异性和灵敏度，又防止了产物被污染而导致的假阳性。
[0038]
进一步的，所述甲、乙型流感病毒和腺病毒核酸检测试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。其中阳性对照包括核酸保护剂、含甲型流感病毒matrix protein基因片段的假病毒颗粒、含乙型流感病毒matrix protein基因片段的假病毒颗粒以及含腺病毒hexon protein基因的puc57载体的混合物，混合后各阳性对照的浓度均为106copies/ml；核酸保护剂包括β-巯基乙醇、二硫苏糖醇(dtt)和三(2-羧乙基)膦(tcep)中的一种或多种的混合物，核酸保护剂具有抑制核酸酶的作用；阴性对照为0.9％的氯化钠溶液。
[0039]
本发明同时要求保护一种甲、乙型流感病毒和腺病毒核酸检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
[0040]
(1)核酸提取：对临床样本进行核酸提取；
[0041]
(2)预处理：取出检测试剂盒中的试剂，融化后离心处理；具体为在室温下融化，充分振荡混匀后瞬间离心；
[0042]
(3)配制pcr反应体系：配制pcr反应体系并分配至pcr反应管中；
[0043]
(4)加样：向步骤(3)的pcr反应管中分别加入临床样本的核酸、阴性对照和阳性对照，得到临床样本反应管、阴性对照反应管和阳性对照反应管，然后离心处理；
[0044]
(5)扩增检测：将pcr反应管放置在pcr仪中进行扩增检测；
[0045]
(6)结果判断：对临床样本的阴阳性进行判断。
[0046]
其中，步骤(1)中，临床样本可以是咽拭子、鼻拭子或痰液样本等，采用磁珠法提取核酸，包括rna和dna，具体为：在核酸提取试剂中加入200μl样品，65℃裂解吸附5min，分离磁珠后，洗涤磁珠1次；晾干磁珠，75℃洗脱磁珠2min，弃磁珠保留洗脱液；优选的，临床样本为鼻咽部样品的抽提液；
[0047]
步骤(2)中，检测试剂盒中的试剂包括引物探针混合液、pcr反应液、防污染酶混合液、阳性对照和阴性对照；pcr反应液中含有pcr增强剂；
[0048]
步骤(3)中，4.5μl引物探针混合液、3μl防污染酶混合液和7.5μlpcr反应液混合成15μl的pcr反应体系；
[0049]
步骤(4)中，分别向步骤(3)中的不同的pcr反应管内加入10μl提取后的洗脱液、阴性对照或阳性对照，得到25μl的pcr反应体系，然后盖紧管盖，瞬时离心；
[0050]
步骤(5)中，pcr扩增的过程及反应条件如下：包括逆转录：50℃、10min；预变性：97℃、2min；变性：97℃、5s；退火、延伸及荧光采集：58℃、30s；其中变性和退火、延伸及荧光采集共进行45个循环；
[0051][0052]
步骤(6)中，结果判断需要同时满足以下条件：所述阴性对照反应管中，fam、vic、rox和cy5通道均无ct值或ct值＞40；所述阳性对照反应管中，fam、vic和rox通道ct值均≦30，扩增曲线呈典型“s”形；否则本次实验无效，需重新实验。
[0053]
具体的，步骤(6)中结果判断的方法为：
[0054]
所述临床样本反应管中，cy5通道扩增出典型“s”形曲线且ct值≦30，同时，fam、vic和rox通道未检测到扩增曲线或ct值＞40，报告为甲型流感病毒、乙型流感病毒和腺病毒阴性。
[0055]
所述临床样本反应管中，cy5通道扩增出典型“s”形曲线且ct值≦30，同时，fam通道检测到典型的s型扩增曲线且ct≦37的样本，报告为甲型流感病毒阳性。
[0056]
所述临床样本反应管中，cy5通道扩增出典型“s”形曲线且ct值≦30，同时，vic通道检测到典型的s型扩增曲线且ct≦37的样本，报告为乙型流感病毒阳性。
[0057]
所述临床样本反应管中，cy5通道扩增出典型“s”形曲线且ct值≦30，同时，rox通道检测到典型的s型扩增曲线且ct≦37的样本，报告为腺病毒阳性。
[0058]
所述临床样本反应管中，cy5通道扩增出典型“s”形曲线且ct值≦30，同时，fam、vic或rox通道检测到扩增曲线且37＜ct＜40的样本，考虑为相应病原体可疑阳性，样本需复测后报告。
[0059]
所述临床样本反应管中，cy5通道未扩增出典型“s”形曲线，无论fam、vic或rox通道是否检测到典型的s型扩增曲线，本次实验均视为无效，应查并排除原因，并重新实验。
[0060]
与现有技术相比，本发明的甲、乙型流感病毒和腺病毒核酸检测试剂盒及使用方法具有以下有益效果：
[0061]
(1)本发明的检测试剂盒中同时含有多种引物和探针的组合，能够同时有效检测甲、乙型流感病毒和腺病毒，并提高了检测效率、降低了检测成本，给呼吸道感染性疾病的鉴别诊断带来了极大的帮助。
[0062]
(2)本发明的检测试剂盒中采用的引物和探针之间交叉二聚体(cross dimer)的δg小于4.7kcal/mol，说明引物和探针序列之间无明显干扰。
[0063]
(3)本发明的检测试剂盒中使用了含有pcr增强剂的pcr反应液，提高了检测灵敏度，满足了临床的需要，实现了呼吸道疾病的早发现、早诊断和早的目的，提高了呼吸道感染性疾病的病原学检测的效率。
[0064]
(4)本发明针对病原微生物特异性保守序列设计引物和探针，具有更高的特异性，避免了与其他流感病毒、呼吸道合胞病毒等呼吸道感染病毒的交叉反应；另外，为了避免由于pcr产物污染引起的假阳性，本发明的pcr反应体系中含有dutp和ung酶，在pcr反应过程的逆转录的同时，ung酶水解含dutp的产物，从而达到了防止污染的目的；因此，本发明可为
临床提供更加可靠的实验证据。
附图说明
[0065]
图1是多组样本在灵敏度分析时检测250copies/ml的甲型流感病毒的pcr反应曲线图。
[0066]
图2是多组样本在灵敏度分析时检测250copies/ml的乙型流感病毒的pcr反应曲线图。
[0067]
图3是多组样本在灵敏度分析时检测250copies/ml的腺病毒的pcr反应曲线图。
[0068]
图4是多组样本在精密度分析时检测1000copies/ml的甲型流感病毒的pcr反应曲线图。
[0069]
图5是多组样本在精密度分析时检测1000copies/ml的乙型流感病毒的pcr反应曲线图。
[0070]
图6是多组样本在精密度分析时检测1000copies/ml的腺病毒的pcr反应曲线图。
[0071]
图7是多组样本在阴阳性符合率分析时甲型流感病毒的pcr反应曲线图。
[0072]
图8是多组样本在阴阳性符合率分析时乙型流感病毒的pcr反应曲线图。
[0073]
图9是多组样本在阴阳性符合率分析时腺病毒的pcr反应曲线图。
[0074]
图10是多组样本在特异性分析时甲型流感病毒的pcr反应曲线图。
[0075]
图11是多组样本在特异性分析时乙型流感病毒的pcr反应曲线图。
[0076]
图12是多组样本在特异性分析时腺病毒的pcr反应曲线图。
[0077]
图13是多组样本在保护作用分析时甲型流感假病毒的pcr反应曲线图。
[0078]
图14是多组样本在保护作用分析时乙型流感假病毒的pcr反应曲线图。
[0079]
图15是多组样本在保护作用分析时腺病毒载体的pcr反应曲线图。
具体实施方式
[0080]
下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
[0081]
实施例中涉及的实验材料：
[0082]
本发明中所使用的核酸提取或纯化试剂(cr-r01)由苏州康容生物医疗有限公司提供，auto-pure32a核酸提取仪购自杭州奥盛仪器有限公司。
[0083]
含有目的片段的puc57载体、引物、探针由无锡赛索飞生物科技有限公司合成和构建。
[0084]
含甲型流感病毒、乙型流感病毒和腺病毒基因片段的假病毒购自汉恒生物科技(上海)有限公司。
[0085]
ung酶、hotstar dna聚合酶、逆转录酶和rna酶抑制剂购自上海百赛生物技术股份有限公司和翌圣生物科技(上海)股份有限公司。
[0086]
dutp、硫酸铵、β-环糊精、tween20和bsa购自上海生物工程有限公司。
[0087]
ma-6000pcr扩增仪购自苏州雅睿生物科技有限公司。
[0088]
实施例1
[0089]
一、配制pcr反应体系及其他试剂：
[0090]
1、将表1中的引物和探针放入离心机中，13000g离心1min，加入相应体积的0.1mm的edta的te缓冲液，配制成终浓度为10μm的引物和探针混合液。
[0091]
表1 pcr反应液中的引物和探针的组合
[0092][0093][0094]
2、向pcr反应管内加入4.5μl的引物和探针混合液、3μl的防污染酶混合液和7.5μl的pcr反应液混合，配制成15μl/管的pcr反应体系。
[0095]
其中防污染酶混合液为：240μm的dutp、0.1u/反应的ung酶、2u/反应的hotstar dna聚合酶、20u/反应的逆转录酶和20u/反应的rna酶抑制剂的混合物；
[0096]
其中pcr反应液中包括pcr增强剂，具体的，pcr增强剂为10mm的硫酸铵、0.5mm的β-环糊精、0.1％的tween20和200μg/ml的bsa的混合物。
[0097]
3、保护性te的配制：在含1mm的edta的te中加入终浓度为5mm的tcep，调整ph值至8.0。
[0098]
4、将含有腺病毒目标片段的puc载体放入离心机中，13000g离心1min，加入相应体积的保护性te，使溶液的质粒浓度为10ng/μl。
[0099]
用nanodrop one微量分光光度计定量浓度后，用含1ng/μl人actin基因组dna的保护性te将载体分别稀释至1.0e+6copies/ml、1.0e+3copies/ml和2.5e+2(250)copies/ml，备用。
[0100]
拷贝数计算公式：copies/μl＝6.02
×
10
23
×
载体初始浓度值(ng/μl)
×
10-9
/(载体碱基数
×
660)。
[0101]
5、用含1ng/μl人actin基因组dna的保护性te将浓度为108copies/ml的含甲、乙型流感病毒序列的假病毒分别稀释至1.0e+6copies/ml、1.0e+3copies/ml和2.5e+2(250)copies/ml，备用。
[0102]
二、操作步骤：
[0103]
1、核酸提取：取已稀释至标化的载体、假病毒或临床样本各200μl，按核酸提取或
纯化试剂(cr-r01)说明书操作，采用磁珠法进行核酸提取。
[0104]
2、pcr扩增
[0105]
在配制好的不同的15μl/管的pcr反应体系中分别加入10μl上一步提取得到的核酸洗脱液、10μl阴性对照或10μl阳性对照，反应总体系为25μl，得到临床样本反应管、阴性对照反应管和阳性对照反应管，低速离心数秒，然后进行pcr扩增，其中pcr扩增条件如下：
[0106]
表2 pcr扩增条件
[0107][0108]
3、结果判断
[0109]
首选需要满足如下条件，才能进行判断，否则实验无效，需重新实验：
[0110]
(1)阴性对照反应管中，fam、vic、rox和cy5通道均无ct值或ct值＞40；
[0111]
(2)阳性对照反应管中，fam、vic和rox通道ct值均≦30，扩增曲线呈典型“s”形。
[0112]
在满足上述条件的基础之上，进行结果判断，判断方法如下：
[0113]
(1)临床样本反应管中，cy5通道扩增出典型“s”形曲线且ct值≦30，同时，fam、vic和rox通道未检测到扩增曲线或ct值＞40的样本，报告为甲型流感病毒、乙型流感病毒和腺病毒阴性。
[0114]
(2)临床样本反应管中，cy5通道扩增出典型“s”形曲线且ct值≦30，同时，fam通道检测到典型的“s”形扩增曲线且ct≦37的样本，报告为甲型流感病毒阳性。
[0115]
(3)临床样本反应管中，cy5通道扩增出典型“s”形曲线且ct值≦30，同时，vic通道检测到典型的“s”形扩增曲线且ct≦37的样本，报告为乙型流感病毒阳性。
[0116]
(4)临床样本反应管中，cy5通道扩增出典型“s”形曲线且ct值≦30，同时，rox通道检测到典型的“s”形扩增曲线且ct≦37的样本，报告为腺病毒阳性。
[0117]
(5)临床样本反应管中，cy5通道扩增出典型“s”形曲线且ct值≦30，同时，fam、vic或rox通道检测到扩增曲线且37＜ct＜40的样本，考虑为相应病原体可疑阳性，样本需复测后报告。
[0118]
(6)临床样本反应管中，cy5通道未扩增出典型“s”形曲线，无论fam、vic或rox通道是否检测到典型的“s”形扩增曲线，本次实验均视为无效，应查并排除原因，并重新实验。
[0119]
实施例2：试剂盒的灵敏度分析
[0120]
按照实施例1中的实施步骤，进行实验。
[0121]
以已稀释至250copies/ml的载体或假病毒为样本，进行核酸提取，每个样本提取20个复孔，pcr扩增以及结果判断按实施例1中的方法进行。
[0122]
结果分别如表3和图1-3所示，检出率为100％，说明灵敏度符合要求(当20个提取复孔的阳性检出数≧19个，即检出率≧95％时，即可判断为灵敏度符合要求)；本发明的试剂盒对甲、乙型流感病毒和腺病毒的检测灵敏度均为250copies/ml。
[0123]
表3本发明检测甲、乙型流感病毒和腺病毒的灵敏度分析结果
[0124][0125]
实施例3：试剂盒的精密度分析
[0126]
按照实施例1中的实施步骤，进行实验。
[0127]
以已稀释至1.0e+3(1000)copies/ml的载体或假病毒为样本，进行核酸提取，每个样本提取20个复孔，pcr扩增以及结果判断按实施例1中的方法进行。
[0128]
结果分别如表4和图4-6所示，检出率均低于1.5％，说明本发明的试剂盒对甲、乙型流感病毒和腺病毒的精密度符合要求(当20个提取复孔ct值的cv值≦5％时，即可判断为精密度符合要求)。
[0129]
表4本发明检测甲、乙型流感病毒和腺病毒的精密度分析结果
[0130][0131]
咽拭子、痰液等临床样本中均含有大量的人基因组dna，检测试剂盒抗人基因组干扰的能力是检验试剂盒性能的重要指标。本发明实施例2和3中使用的样本是以含1ng/μl人基因组dna的保护性te稀释的载体和假病毒，实施例2和3的结果表明人基因组对甲、乙型流感病毒和腺病毒检测灵敏度和精密度没有影响，说明本发明试剂盒具有良好的抗基因组干扰的能力。
[0132]
实施例4：试剂盒的阴阳性符合率分析
[0133]
按照实施例1中的实施步骤，进行实验。
[0134]
选择经三级医院检测后判读甲型流感病毒、乙型流感病毒和腺病毒均为阴性的5个咽拭子样本；选择经三级医院检测后判读甲型流感病毒为阳性的5个咽拭子样本、乙型流感病毒为阳性的5个咽拭子样本，腺病毒为阳性的5个咽拭子样本。以这些临床样品为样本，进行核酸提取，pcr扩增以及结果判断按实施例1中的方法进行。
[0135]
结果分别如表5和图7-9所示，阴阳性符合率为100％，说明本发明的试剂盒对甲、乙型流感病毒和腺病毒的阴阳性符合率符合要求。
[0136]
表5本发明检测临床样本中甲、乙型流感病毒和腺病毒的阴阳性符合率结果
[0137][0138][0139]
实施例5：试剂盒的特异性分析
[0140]
按照实施例1中的实施步骤，进行实验。
[0141]
以含1ng/μl人基因组dna的保护性te为样本，进行核酸提取，每个样本提取5个复孔。pcr扩增以及结果判断按实施例1中的方法进行。如图10-12所示，5个提取复孔的甲、乙型流感病毒和腺病毒阳性检出数均为0个，判断为本发明试剂盒具有良好的检测特异性。
[0142]
另外，实施例4中使用的均为咽拭子样本，因为咽拭子样本中除了人基因组dna以外，还含有大量的微生物比如链球菌、表皮葡萄球菌、念珠菌和奈瑟菌等，经过提取，这些微生物的基因组也含在提取后的临床样本中。实施例4的结果表明，5个阴性咽拭子样本和15个阳性咽拭子样本中未出现假阳性。该结果进一步说明本发明的检测试剂盒对甲、乙型流感病毒和腺病毒检测具有良好的特异性。
[0143]
实施例6：试剂盒的保护作用分析
[0144]
按照实施例1中的实施步骤，进行实验。
[0145]
分别用含保护剂和不含保护剂的te，将载体或假病毒稀释至1.0e+3(1000)copies/ml后，置于2-8℃两周后，进行核酸提取，每个样本提取10个复孔，pcr扩增以及结果判断按实施例1中的方法进行。
[0146]
如表6和图13-15所示，含保护剂的甲型流感假病毒的平均ct为32.99，不含保护剂的甲型流感假病毒的平均ct值为37.42，两者差值为4.43；含保护剂的乙型流感假病毒的平均ct为32.84，不含保护剂的乙型流感假病毒的平均ct值为36.20，两者差值为3.36；含保护剂的腺病毒载体的平均ct为32.97，10个不含保护剂的腺病毒载体有7个样本未检出ct值；可见含保护剂与不含保护剂的假病毒或载体的平均ct值差值大于2，判断为保护剂有效，说明本发明试剂盒中的保护剂对假病毒和载体均具有很好的保护作用。
[0147]
表6本发明中核酸保护剂对甲、乙型流感假病毒和腺病毒载体的保护作用结果
[0148][0149][0150]
由此可见，本发明根据病原体核酸的保守区域设计引物和探针，通过实时荧光pcr技术联合检测甲、乙型流感病毒rna和腺病毒核酸dna，在提高检测灵敏度和特异性的同时还提高了检测效率、降低了检测成本，给呼吸道感染性疾病的鉴别诊断带来了极大的帮助。同时，本发明得检测试剂盒可同时检测样本中的甲、乙型流感病毒和腺病毒核酸，在提高检测效率、降低了检测成本的同时，有助于疾病的鉴别诊断；含增强剂的pcr反应液使本发明具有更高的检测灵敏度，适用于痰液、鼻咽拭子等多种样本的检测；针对病原体核酸得特异性保守序列设计的引物和探针，具有更高的特异性，避免了与其他病原微生物的交叉反应，
并且本发明引物探针序列之间无明显干扰；为避免由于pcr产物污染引起的假阳性，本发明的pcr反应体系中含有dutp和ung酶，在pcr反应过程的逆转录的同时，ung酶可水解含dutp的产物，从而达到了防止污染的目的。
[0151]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用于限制发明，凡在本发明的设计构思之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.一种甲、乙型流感病毒和腺病毒核酸检测试剂盒，用于甲型流感病毒、乙型流感病毒和腺病毒的同时检测，其特征在于：包括如下引物和探针的组合：2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒中还包括用于内标的人actin基因检测的引物和探针，所述用于内标的人actin基因检测的引物和探针的序列分别为：人actin基因上游引物序列：5
’‑
gatcccagaggtgcatta-3’；人actin基因下游引物序列：5
’‑
agtcctccagatcctttg-3’；人actin基因探针序列：5
’‑
cy5-caagccagttaccatgaggaatcc-3’。3.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒中还包括pcr增强剂，所述pcr增强剂包括硫酸铵、β-环糊精、tween20和bsa中的一种或多种的混合物。4.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒中还包括防污染酶混合液，所述防污染酶混合液包括dutp、ung酶、hotstar dna聚合酶、逆转录酶和rna酶抑制剂中的一种或多种的混合物。5.如权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒中还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照包括核酸保护剂、含甲型流感病毒matrix protein基因的假病毒颗粒、含乙型流感病毒matrix protein基因的假病毒颗粒以及含腺病毒hexon protein基因片段的载体的混合物；所述阴性对照为0.9％的氯化钠溶液。6.如权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于：所述核酸保护剂包括β-巯基乙醇、二硫苏糖醇和三(2-羧乙基)膦中的一种或多种的混合物。7.一种如权利要求6所述的检测试剂盒的使用方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)核酸提取：对临床样本进行核酸提取；(2)预处理：取出检测试剂盒中的试剂，融化后离心处理；(3)配制pcr反应体系：配制pcr反应体系并分配至pcr反应管中；(4)加样：向步骤(3)的pcr反应管中分别加入临床样本的核酸、阴性对照和阳性对照，得到临床样本反应管、阴性对照反应管和阳性对照反应管，然后离心处理；(5)扩增检测：将pcr反应管放置在pcr仪中进行扩增检测；(6)结果判断：对临床样本的阴阳性进行判断。
8.如权利要求7所述的使用方法，其特征在于：步骤(5)的核酸扩增条件为：9.如权利要求7所述的使用方法，其特征在于：步骤(6)需满足以下条件，才可进行结果判断，否则，本次实验无效，需重新实验：所述阴性对照反应管中，fam、vic、rox和cy5通道均无ct值或ct值＞40；所述阳性对照反应管中，fam、vic和rox通道ct值均≦30，扩增曲线呈典型“s”形。10.如权利要求9所述的使用方法，其特征在于：步骤(6)的结果判断方法为：所述临床样本反应管中，cy5通道扩增出典型“s”形曲线且ct值≦30，同时，fam、vic和rox通道未检测到扩增曲线或ct值＞40时，报告为甲型流感病毒、乙型流感病毒和腺病毒阴性；所述临床样本反应管中，cy5通道扩增出典型“s”形曲线且ct值≦30，同时，fam通道检测到典型的s型扩增曲线且ct≦37时，报告为甲型流感病毒阳性；所述临床样本反应管中，cy5通道扩增出典型“s”形曲线且ct值≦30，同时，vic通道检测到典型的s型扩增曲线且ct≦37时，报告为乙型流感病毒阳性；所述临床样本反应管中，cy5通道扩增出典型“s”形曲线且ct值≦30，同时，rox通道检测到典型的s型扩增曲线且ct≦37时，报告为腺病毒阳性；所述临床样本反应管中，cy5通道扩增出典型“s”形曲线且ct值≦30，同时，fam、vic或rox通道检测到扩增曲线且37＜ct＜40时，考虑为相应病原体可疑阳性，样本需复测后报告；所述临床样本反应管中，cy5通道未扩增出典型“s”形曲线，无论fam、vic或rox通道是否检测到典型的s型扩增曲线，本次实验均视为无效，应查并排除原因，并重新实验。

技术总结

本发明公开了一种甲、乙型流感病毒和腺病毒核酸检测试剂盒及使用方法，属于生物技术领域。检测试剂盒中包括分别针对甲型流感病毒的MatrixProtein基因、乙型流感病毒的MatrixProtein基因和腺病毒核酸的hexonProtein基因设计得到的引物和探针的组合，还包括用于内标的人Actin基因检测的引物和探针。本发明的检测试剂盒能够同时有效检测甲、乙型流感病毒和腺病毒，引物和探针针对病原微生物特异性保守序列进行设计，因此检测特异性高；且使用了含有增强剂的PCR反应液，检测灵敏度高；能够为临床提供更可靠的实验证据，满足临床需要。满足临床需要。满足临床需要。