摘要：MicroRNAs(miRNAs)是一类分布广泛的小的非编码蛋白质的RNAs，其功能是负调控基因表达。它们调节了多种生物学信号通路，生物信息学数据显示，每个miRNA 可以调节数百个靶基因，这也表明miRNAs 可能影响所有的信号途径。最近的证据表明，miRNA 突变或者异位表达与多种人类癌症相关，miRNAs 可以起到肿瘤抑制基因或者癌基因的功能。研究表明miRNAs 可以抑制重要的肿瘤相关基因的表达，可能在癌症的诊断和中起重要作用。肿瘤是由于细胞不受控制的增殖，受到损伤的细胞不能正常死亡引起的。细胞有几种保护措施，保证在发育过程中和成体中的细胞通过一种协调的机制，进行正常的分裂，分化，和死亡。多种调控因子通过基因表达的开关，调节细胞分裂和分化。在肿瘤，被称为肿瘤抑制基因和癌基因表达失调。大多数肿瘤抑制基因和癌基因都是从DNA 转录成RNA，然后翻译成蛋白质，行使其生物学功能。最近的证据表明，非编码蛋白的RNA 分子，被称为microRNAs (miRNAs)，也可以起到肿瘤抑制基因和癌基因的作用。 关键词：MicroRNA;肿瘤;
1. MircoRNA
MicroRNA（miRNA）是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA,是发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。其在细胞内具有多种重要的调节作用。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNAs也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达。随着miRNA调控基因表达的研究的逐步深入，将帮助我们理解高等真核生物的基因组的复杂性和复杂的基因表达调控网络。miRNA广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，其本身不具有开放阅读框（ORF）。成熟的miRNA，5′端有一个磷酸基团，3′端为羟基。编码miRNAs的基因最初产生一个长的pri-RNA分子，这种初期分子还必须被剪切成约70-90个碱基大小、具发夹结构单链RNA前体（pre-miRNA）并经过Dicer酶加工后生成。成熟的miRNA 5’端的磷酸基团和3´端羟基则是它与相同长度的功能RNA降解片段的区分标志。miRNA 5＇端第一个碱基对U（尿苷）有强烈的倾向性，而对G却排斥，但第二到第四个碱基缺乏U。一般来讲，除第四个碱基外，其他位置碱基通常都缺乏C。这些分子能够与那些和它的序列互补的mRNA分子相结合，有时候甚至可以与特定的DNA片断结合。这种结合的结果就是导致基因的沉默。这种方式是身体调节基因表达的一个重要策略。据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因。
1.1MicroRNA的形式
1. pre-miRNA
约70bp含microRNA茎环结构的pre-miRNA。
制备方式：化学合成、生物转录合成、pre-miRNA质粒表达载体、pre-miRNA病毒。
2. pri－miRNA
天然pri－miRNA
从染体基因文库中调取300bp－1000bp完整的microRNA基因，克隆到质粒载体（普通载体或病毒载体），以强大的CMV启动子操纵该300bp－1000bp microRNA。
人工pri－miRNA
选择一个完整的microRNA基因，克隆到质粒载体（普通载体或病毒载体）。以人工合成的约70bp含miRNA茎环结构的目标pre-RNA替代原pre-RNA，并以pol Ⅱ/pol III 启动子操纵该microRNA结构单元。
1.2 MicroRNA的作用方式
miRNA基因是一类高度保守的基因家族，按其作用模式不同可分为三种：第一种以线虫lin-4为代表，作用时与靶标基因不完全互补结合，进而抑制翻译而不影响mRNA的稳定性（不改变mRNA丰度），这种miRNA是目前发现最多的种类；第二种以拟南芥miR-171为代表，作用时与靶标基因完全互补结合，作用方式和功能与siRNA非常类似，最后切割靶mRNA；第三种以let-7为代表，它具有以上两种作用模式：当与靶标基因完全互补结合时，直接靶向切割mRNA，如果蝇和Hela细胞中let-7直接介导RISC分裂切割靶mRNA；当与靶标基因不完全互补结合时，起调节基因表达的作用，如线虫中的let-7与靶mRNA3´端非翻译区不完全配对结合后，抑制调节基因的翻译。
1.3 MiRNA的特异性
研究表明MiRNAs在物种间具有高度的保守性、时序性和组织特异性——在特定的时间、组织才会表达。
细胞特异性或组织特异性是miRNA表达的主要特点，又如拟南芥中的miR-171仅在其花序
中高水平表达，在某些组织低水平表达，在茎、叶等组织中却无任何表达的迹象；20-24h的果蝇胚胎提取物中可发现miR-12，却不到miR3-miR6，在成年果蝇中表达的miR-1和let-7也无法在果蝇胚胎中表达，这同时体现了miRNA的又一特点——基因表达时序性。MiRNA表达的时序性和组织特异性暗示miRNA的分布可能决定组织和细胞的功能特异性，也可能参与了复杂的基因调控，对组织的发育起重要作用。
siRNA是RNAi途径的主要作用物,miRNA和siRNA很容易混淆，他们有许多共同点也有许多不同点。为了能够清楚地让读者弄清两者之间的差异之处，笔者特别将它们之间的差别划分入三个大的阶段：起源阶段、成熟阶段和功能阶段（即调节基因表达的作用阶段）。
2 miRNAs 是一大类基因表达调控因子
miRNAs 是由约22 个核苷酸组成的非编码的单链RNAs，这是一类在动植物中新发现的基因表达调控因子。它们通过依赖于miRNA 和靶基因的互补性的两种不同的机制反向调控靶基因的表达。当miRNAs 和编码蛋白质的mRNA 几乎完全配对时，miRNAs 诱导RNA介导（RNAi）的干扰途径。简而言之，mRNA 转录本在miRNA 关联的多蛋白RNA 介导的沉默复合体（miRISC）中被核酸酶剪切，导致靶mRNA 的降解。这种miRNA 介导的基因沉默
机制在植物中比较普遍，但在哺乳动物中也有发现。然而，绝大多数哺乳动物中的miRNAs 并不导致靶mRNA 的降解，而是通过另外一种机制进行基因表达调控的。这些miRNAs 通过不完全的碱基配对和mRNA 的3mirna靶基因分析’非翻译区（UTRs）,在一个类似于或者可能是等同于RNA 干扰途径中使用的RISC 复合物中，在转录后水平上抑制基因翻译。与抑制翻译一致的是，通过这种机制控制翻译的miRNAs 仅降低其靶基因的蛋白质表达水平，但其mRNA 水平几乎没有受到什么影响。然而，最近的一些发现表明，miRNAs 与它们的靶基因只有部分互补的情形也会导致mRNA 的降解，但是目前还不清楚，翻译抑制是否发生在mRNA 的降解之前。
miRNAs 的生物合成最近才得到了比较详细的阐明。miRNAs，通常是由RNA 聚合酶II (Pol II) 转录的，最初产物是被称为pri-miRNA 的大的前体分子。pri-miRNAs 在细胞核内被RNase III Drosha 和双链RNA 结合蛋白Pasha 处理成约70 个核苷酸组成的pre-miRNA，这种分子为一个不完全的茎环结构。RAN 和GTP 依赖的exportin 5 将这种前体分子输送到细胞质中。茎环结构随后被另一个RNase III Dicer 处理，剪切产生约22 个核苷酸长度的miRNA：miRNA* 双链。然后这种双链很快被整合到miRISC 复合体中。成熟的miRNA 保留在具有功能的复合物中，对靶基因表达进行反向调控。
在二十年前研究人员最初发现miRNAs 时，并没有意识到这些miRNAs 的重要性。因为，第一个在线虫中发现的在其生命周期中控制时序发育的miRNAs 基因lin-4 被认为是线虫中独有的。然而，通过传统的克隆方法和生物信息学手段发现在线虫、果蝇、哺乳动物中存在着数百个miRNAs，这引起了各领域科学家的重视。据估计，在人类基因组中至少存在300 个miRNAs(也有可能为1000 个)，约占人类基因的~1-4%，这使得其成为最大的一类基因表达调控因子。大多数人类的miRNAs 位于编码蛋白或者非编码蛋白的mRNA 转录本的内含子区域。其余的miRNAs 位于基因组的转录本之间，或者在mRNA 非编码的外显子区域，或者是mRNA3’非翻译区域。此外，也有的几个miRNAs 聚集在一起，成为一个miRNA基因簇，如19 号染体上的由54 个miRNAs 组成的一个基因簇。通过序列同源性可以对miRNAs 进行分组归类。研究发现，成熟miRNA 通常在5’端同源性较高，但是同一个miRNA家族的成员是否调控类似的生物学过程仍需要进一步研究。很多miRNAs 在线虫到人类的进化过程中是保守的，这预示着这些miRNAs 在发育过程和成体中引导了基本的生物学过程。
3 miRNAs 调节多个靶基因
目前的挑战是精确的鉴定miRNAs 所调节的靶基因。由于miRNAs 和其结合位点并不是完全互补的，可以存在短的错配和G–U 配对，因此，通过简单的BLAST 确定其靶基因是不可能的。但是，最近的生物信息学手段开始利用同一家族的成熟miRNAs 在5’末端具有高度的同源性这一特点。数项研究表明，miRNA 的5’末端对于miRNA 进入miRISC，并在其中保持稳定是非常重要的，而且，这一末端对于其生物学功能也相当关键。因此，大多数生物信息学算法利用一个包含了成熟miRNA 的2-8 位的碱基序列的“miRNA seed”来搜索所有基因的3’非编码区域的互补序列。这些研究发现一个单独的miRNA 可以结合多达200个靶基因，而这些靶基因可以行使不同的功能，包括转录因子，分泌蛋白，受体，转运蛋白。所以，miRNAs 可能控制着1/3 的人类基因的表达。然而，通过“miRNA seed”搜索会错过很多靶基因，有证据表明，在2-8 位核苷酸以外的变化也会影响miRNA 的调节功能。例如，整个成熟的let-7 miRNA 序列在线虫和人中是保守的，说明其3’端也具有生物学功能。而且，我们实验室的突变研究发现let-7 miRNA 的5’端和3’端对于一个靶基因的调控都是必需的。因此，已知的miRNA 的数目可能进一步的增加，如何确定预测所得的靶基因在生物学上确实与miRNA 相关也是一个难题。研究还发
现单个基因的3’非翻译区域具有几个miRNAs 的结合位点，这表明miRNAs 调控基因表达存
在着复杂的组合模式。由于miRNAs 可能调节数个信号通路，这些小RNAs 的缺失或者异常表达可能与疾病密切相关，包括肿瘤。
4 miRNA 相关的基因和人类肿瘤
研究表明miRNA 生物合成的组成部分与肿瘤发生有关。在肺癌中发现Dicer 的表达下调。Karube 等检测了67 个非小细胞肺癌样品中的DICER 和DROSHA 的RNA 表达水平。他们发现DICER 的表达量下降与术后存活期缩短相关，这表明了Dicer 可能阻止肺组织的转化。由于Dicer 与异染质的维持和中心粒沉默有关，其蛋白质水平的降低可能直接导致基因组的不稳定，从而引起肿瘤形成。然而，Kanellopoulou 等最近证实缺少Dicer 的鼠胚胎干细胞尽管有异染质不足的现象发生，但并不引起染体的数目或者结构失常，并且注射这些缺少Dicer 的胚胎干细胞到裸鼠中也不会导致肿瘤发生。因此，Dicer 在肿瘤发生中的作用可能是非直接的，可能是通过其缺失而导致了具有肿瘤抑制因子效应的miRNAs 的减少起作用的。小鼠Dicer 基因的缺失研究表明这个基因在哺乳动物发育和干细胞正常分化、T 细胞发育、四肢形成的重要性，这也预示着成熟的miRNAs 在这些过程中起作用。因此，肺癌和Dicer 的联系表明了这个基因在肺组织分化中的作用，并且可能它可能是通过miRNAs 起作用的。
蛋白Argonaute 是短的干扰RNA（siRNA）和miRNA 介导的基因调节RISC 复合物的至关重要的组成部分，也与多种肿瘤有关。3 个人的Argonaute 基因——AGO3(又称真核转录起始因子2 亚基2(EIF2C3))，AGO1(又称EIF2C1)和AGO4(又称EIF2C4)，前后排列在1 号染体(1p34–35)——在wilms 肾癌中经常缺失，还与神经外胚层瘤有关。AGO1 在肺和肾的发育过程中高表达，在缺少Wilms 肿瘤抑制基因WT1 的肾癌中表达显著上升。这表明，AGO1 在这些组织在胚胎发生的分化过程中起重要作用。另一个Argonaute 基因，HIWI，与果蝇中piwi 功能类似的基因，定位在基因组12q24.33，而这一位点与睾丸生殖细胞肿瘤有关。这种睾丸特异表达的基因在19 份睾丸精原细胞瘤的12 份样品中表达上升。这些研究表明，HIWI 可能具有癌基因的活性，可能控制了生殖细胞的分裂和维持。进一步研究这个介导miRNA 加工和miRNA 抑制基因表达的复合物的组成部分对于设计利用miRNAs 肿瘤等疾病的药物是必不可少的。
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