⼲货--microRNA必备知识系列
简介
MicroRNA (miRNA) 是⼀类内⽣的、长度约为20-24个核苷酸的⼩RNA，其在细胞内具有多种重要的调节作⽤。每个miRNA可以有多个靶基因，⽽⼏个miRNA也可以调节同⼀个基因。这种复杂的调节⽹络既可以通过⼀个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过⼏个miRNA的组合来精细调控某个基因的表达。据推测，miRNA调节着⼈类三分之⼀的基因。最近的研究表明⼤约70 %的哺乳动物miRNA 基因是位于TUs区( transcription units , TUs ) ( Rodriguez et al ,2004) ，且其中⼤部分是位于内含⼦区( Kim &Nam , 2006) 。⼀些内含⼦miRNA 基因的位置在不同的物种中是⾼度保守的。miRNA 不仅在基因位置上保守, 序列上也呈现出⾼度的同源性(Pasquinelli etal , 2000 ; Ruvkun et al , 2001 ; Lee & Ambros ,2001) 。miRNA ⾼度的保守性与其功能的重要性有着密切的关系。miRNA 与其靶基因的进化有着密切的联系, 研究其进化历史有助于进⼀步了解其作⽤机制和功能。 MicroRNA
MicroRNA（miRNA）是⼀类内⽣的、长度约20-24个核苷酸的⼩RNA，⼏个miRNAs也可以调节同⼀个基因。可以通过⼏个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达。据推测，miRNA调节着⼈类三分之⼀的基因。
MicroRNA存在多种形式，最原始的是pri-miRNA，长度⼤约为300~1000个碱基；pri-miRNA经过⼀次加⼯后，成为pre-miRNA即microRNA前体，长度⼤约为70~90个碱基；pre-miRNA再经过Dicer酶酶切后，成为长约20~24nt的成熟miRNA。
实际研究中，pre-miRNA应⽤最早，也最⼴泛，很多商业化的MicroRNA库都是pre-miRNA形式的。近⼏年来，研究发现microRNA的双臂对成熟miRNA的形成有着⼗分重要的作⽤，所以天然的pri-miRNA形式越来越多地被研究者采⽤。
MicroRNAs (miRNAs)是⼀种⼤⼩约21—23个碱基的单链⼩分⼦RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基⼤⼩的单链RNA前体经过Dicer酶加⼯后⽣成，不同于siRNA（双链）但是和siRNA密切相关。据推测，这些⾮编码⼩分⼦RNA（miRNAs）参与调控基因表达，但其机制区别于siRNA介导的mRNA降解。第⼀个被确认的miRNA是在线⾍中⾸次发现的lin-4 和let-7，随后多个研究⼩组在包括⼈类、果蝇、植物等多种⽣物物种中鉴别出数百个miRNAs。
特征
已经被鉴定的miRNAs据推测⼤都是由具有发夹结构，约70个碱基⼤⼩形成发夹结构的单链RNA前体经过Dicer酶加⼯后⽣成的，有5’端磷酸基和3’羟基，⼤⼩约21—25nt的⼩分⼦RNA⽚断，定位于RNA前体的3’端或者5’端。
3个研究⼩组分别从线⾍、果蝇和Hela细胞中鉴定的100个新miRNAs中，有15%跨越线⾍、果蝇和哺乳动物基因组具有⾼度的保守性（只有有1—2个碱基的区别）。Lau 和Bartel 实验室的同事更加认为：所有的miRNAs可能在其他物种中具有直向同源物（Ortholog，指那些起源于同⼀祖先，在不同⽣物体中⾏使同⼀功能的基因就可⽐作为⼀个门类，这些类似的基因被称 为“直向同源物”）。
Bantam 最早被认为是果蝇中参与细胞增殖的⼀个基因位点。已知⼏个包含增强⼦的转座⼦插⼊跨越这个位点的⼀段12.3kb区域会导致果蝇的眼和翅重复⽣长，⽽由转座⼦介导的⼀段跨越该位点的23kb⽚断缺失则导致突变果蝇个体⼩于野⽣型果蝇。Cohen和同事⽤⼀段3.85kb的⽚断导⼊21kb⽚断缺失的果蝇中使其恢复原来的⼤⼩。但是奇怪的是表达这个3.85kb⽚断中的EST 却没有同样的效果。Cohen将这个⽚断和疟蚊Anopheles gambiae的同源序列进⾏⽐较，发现⼀段90bp的⾼度保守区，经过RNA folding program (mfold)发现这个保守序列可以形成发夹结构，使得这个区段很象是⼀个miRNA的前体。这个结果经过Northern blot证实突变果蝇的幼体
缺少⼀个21bp的bantam miRNA ，⽤这个90bp的mRNA前体经过⼀系列的“功能缺失”—“功能恢复”实验，证实 bantam miRNA在细胞增殖中的作⽤。研究⼈员⽤计算机程序检索在hid mRNA 的3’⾮编码区到了bantam的3个潜在的结合位点（ hid是果蝇中⼀个诱导凋亡的基因），并证实 bantam miRNA抑制hid 的翻译⽽⾮转录。
miRNAs的表达⽅式各不相同。部分线⾍和果蝇的miRNA在各个发育阶段的全部细胞中都有表达，⽽其他的miRNA则依据某种更为严谨的位相和时相的表达模式（a more restricted spatial and temporal expression pattern）——在不同组织、不同发育阶段中miRNA的⽔平有显著差异。
功能
科学家开始认识到这些普遍存在的⼩分⼦在真核基因表达调控中有着⼴泛的作⽤。在线⾍，果蝇，⼩⿏和⼈等物种中已经发现的数百个miRNAs中的多数具有和其他参与调控基因表达的分⼦⼀样的特征——在不同组织、不同发育阶段中miRNA的⽔平有显著差异，这种miRNAs表达模式具有分化的位相性和时序性（ differential spatial and temporal expression patterns），提⽰miRNAs有可能作为参与调控基因表达的分⼦，因⽽具有重要意义。
第⼀个被确认的miRNA——在线⾍中⾸次发现的lin-4和let-7，可以通过部分互补结合到⽬的mRNA靶的3’⾮编码区(3’UTRs)，以⼀种未知⽅式诱发蛋⽩质翻译抑制，进⽽抑制蛋⽩质合成，通过调控⼀组关键mRNAs的翻译从⽽调控线⾍发育进程(reviewed in Pasquinelli 2002)。bantam miRNA是第⼀个被发现有原癌基因作⽤的miRNA。除了lin-4、let-7，已知还有⼀些miRNAs可能参与在细胞分化和组织发育过程中起重要作⽤的基因的转录后调控，例如mir-14、mir-23 等。
在植物miRNAs的研究中有两条线索提⽰miRNAs可能参与植物的发育过程。⼀是在carpel factory (car)
突变株中3个miRNAs的表达⽔平显著下降。CARPEL FACTORY 是⼀个类似Dicer 的酶，参与植物的发育，其缺失突变株表现为胚胎和叶⽚发育的缺陷。实验结果提⽰这种缺陷是由于缺少miRNAs加⼯⽽造成的。多数的植物miRNAs在某些特定组织中⾼⽔平表达也提⽰他们可能参与了植物组织的发育。
对⼀部分miRNAs的研究分析提⽰：miRNAs参与⽣命过程中⼀系列的重要进程，包括早期发育(Reinhart 2000)，细胞增殖，细胞凋亡，细胞死亡(Brennecke 2003），脂肪代谢（Xu 2003)和细胞分化(Kawasaki 2003)。此外，⼀个研究表明，2个miRNAs⽔平的下降和慢性淋巴细胞⽩⾎病之间的显著相关，提⽰miRNAs和癌症之间可能有潜在的关系(Calin 2002)。
由于miRNAs存在的⼴泛性和多样性，提⽰miRNAs可能有⾮常⼴泛多样的⽣物功能。尽管对miRNA的研究还处于初级阶段，据推测miRNAs在⾼级真核⽣物体内对基因表达的调控作⽤可能和转录因⼦⼀样重要。有⼀种看法是：miRNAs可能代表在⼀个新发现的层次上的基因表达调控⽅式。
然⽽，⼤多数miRNAs的功能仍然是个谜。
MicroRNA的过表达
MicroRNA存在多种形式，最原始的是pri-miRNA ，长度⼤约为300-1000个碱基pri-miRNA经过⼀次加⼯后，成为pre-miRNA 即microRNA前体，长度⼤约为70-90个碱基；pre-miRNA再经过Dicer酶酶切后，成为长约20-24nt的成熟miRNA 。
实际研究中，pre-miRNA应⽤最早，也最⼴泛，⽬前很多商业化的MicroRNA库都是pre-miRNA 形式的。近⼏年来，研究发现microRNA的双臂对成熟miRNA的形成有着⼗分重要的作⽤，所以天然的pri-miRNA形式越来越多地被研究者采⽤。
MicroRNA的下调
赢润⽣物可以提供化学合成的miRNA inhibitors ，⽤于下调⽬的细胞中的miRNA ，以实现loss-of function研究。
如果您需要进⾏长期、稳定的miRNA下调，则可以选⽤赢润⽣物构建的载体形式的miRNA inhibitor。其转染效率⾼，下调效果好，可以实现对⽬的miRNA的长期、稳定的下调。
赢润⽣物载体形式的miRNA inhibitor，采⽤的是miRNA sponge法，这也是⽬前SCI⽂献中⽤的较多的⼀种⽅法。
作⽤⽅式
microRNA-RISC对靶基因mRNA的作⽤⼀直主要取决于它与靶基因转录体序列互补的程度，有三种⽅式。
第⼀种是切断靶基因的mRNA分⼦——miRNA与靶基因完全互补结合，作⽤⽅式和功能与siRNA⾮常相似，最后切割靶mRNA。在植物中，⼤部分miRNA都以这种⽅式，靶基因mRNA 断裂后，⽆poly(A)的分⼦的3‘ 端加上多个U并很快降解，含poly(A)的分⼦能稳定存在⼀段时间（如拟南芥miR-171）。在植物中⽬前有⼀个miRNA和3个潜在的⽬标靶基因完全互补（这些scarecrow 基因编码潜在的转录因⼦），尽管还不清楚这些基因是否就是miRNA的⽬标靶，这仍是第⼀次发现miRNA 和其潜在的⽬标靶完全互补，也提⽰miRNA可能包含和siRNA类似的作⽤⽅式。
第⼆种是抑制靶基因的翻译——作⽤时与靶基因不完全互补结合，进⽽阻遏翻译⽽不影响mRNA的稳定性，这种miRNA是⽬前发现最多的种类（如线⾍lin-4）。⽽在植物中极少数的miRNA通过此⽅式来抑制靶基因。
第三种是结合抑制——具有以上两种作⽤模式：当与靶基因互补结合时，直接靶向切割mRNA；当与靶基因不完全结合时，起调节基因表达的作⽤。[1]
识别⽅法
多个研究⼩组采⽤⽣物化学结合是⽣物信息学的⽅法开展对miRNAs的研究⼯作。由于据推测都是由Dicer酶降解RNA得到的，21—23个碱基⼤⼩、有5’端磷酸基和3’羟基的RNA⽚断，有的实验室采⽤改良的定向克隆⽅法来筛选具有相同特征的⼩分⼦——筛选⼀定⼤⼩的RNA分⼦，连接到3’和5’的适配⼦
（adapters），逆转录并通过PCR扩增、亚克隆并测序。miRNA前体在基因组上的定位和聚类是通过向基因组数据库查询进⾏。这个⽅法有助于判断miRNAs是否是mRNAs、tRNAs、rRNAs等分⼦的降解产物。
有的实验室通过⼀种RNA folding program ’mfold’ 来判断C. elegans 和C. briggsae 之间的⾼度保守区域是否含有潜在的miRNA前体，然后⽤Northern Blots的⽅法来确定这些miRNAs是否真的表达了。
尽管有数百个miRNAs通过⽣化或者是⽣物信息学的⽅法被鉴别出来，已经鉴别出来的miRNAs 只不过是沧海⼀粟，由于很多已经鉴别出来的miRNAs是从单个克隆中鉴别出来的，所以可以假设还有很多miRNAs在分离和鉴定过程中被“漏掉”了，测序⼯作还远远不够。
siRNA
miRNA和siRNA之间的关系令⼈迷惑。从表⾯上说，⼀个是⾮编码的单链⼩分⼦RNA，在进化上⾼度保守，通过翻译抑制调控基因表达；另⼀个是针对编码区的双链⼩分⼦RNA，每个转录本都可能有很多个siRNAs，是通过降解⽬标靶，在转录后调控基因表达。由于每个mRNA模版可能产⽣很多个siRNAs，要给每个siRNA定⼀个基因的名字就很困难。miRNA是进化进程中⾼度保守的，因此给直向同源物⼀个同样的名字可能有助于了解他们的功能，⽽给另⼀个物种中⼀段⽆关的序列⼀个同样的名字就容易造成混乱。
然⽽，据推测miRNAs通常是由较⼤的（7090 nt）的茎环结构（发夹结构）前体经Dicer 酶切割得到的，⽽Dicer同样负责将长双链RNA切割为siRNA，⽽且⼆者的长度也差不多，同样有调控基因表达功能。因⽽这两类⼩分⼦RNA之间的关系格外令⼈关注。
两个⼴为⼈知的miRNA——在线⾍中⾸次发现的lin-4 和let-7，通过⼀种未知⽅式诱发蛋⽩质翻译抑制从⽽抑制蛋⽩质合成。这种结合并不诱导mRNA靶的降解，就是说作为翻译抑制⼦本⾝不影响对应mRNA的丰度，其原因据推测是由于miRNA和结合位点之间不完全互补。这就区别于siRNA的介导的mRNA的降解。但是其他⼀些miRNAs可能以类似siRNA的⽅式介导⽬的RNA 的降解。实验表明引⼊和let-7⽬的mRNA靶完全互补的miRNA会诱导mRNA靶的降解。还有实验结果表明⼀些miRNA，包括在植物中发现的Scarecrow miRNA，能结合完全互补的mRNA链从⽽降解mRNA序列，抑制蛋⽩合成。这提⽰miRNAs可以和siRNAs⼀样作⽤，这两种⼩分⼦
RNA作⽤通路可能有重叠的部分。这种重叠同样提⽰siRNAs可能也有和miRNAs同样的功能。
⼀个很有趣的实验证实这个观点：Doench和同事挑选⼀个已知在体内可以有效使CXCR4基因沉默的siRNA，然后在荧光素酶报告基因的3’端插⼊对应的CXCR4结合位点——其中⼀个拷贝是插⼊⼀个完全匹配的CXCR4结合位点，另⼀个拷贝插⼊4个只有3’和5’端匹配，⽽中间不同的CXCR4结合位点，这样选定的siRNA就不能完全结合到这个结合位点——中间形成⼀个突起的不匹配的环。将这两个拷
贝转⼊Hela细胞并⽤siRNA诱导基因沉默。结果很有趣——两个实验都录得荧光素酶活性下降了超过10倍，RT-PCR和Northern分析证实，第⼀个实验的荧光素酶转录本下降了超过10倍，这正是正常的siRNA介导的RNAi反应，⽬标靶mRNA降解导致表达⽔平的下降，⽽第⼆个实验中荧光素酶转录本仅仅下降1.2倍，这种⽬的基因表达⽔平下看起来象源于miRNA介导的翻译抑制降，⽽不是siRNA介导的影响mRNA的稳定性导致。实验表明：siRNA可能以miRNA的⽅式作⽤于mRNA。实验⼈员还进⾏了另⼀个实验：改变第⼆个实验中的不匹配环的碱基序列看起来不影响抑制效果，但是siRNA和报告基因上的结合位点的匹配程度越⾼抑制效果越好，增加siRNA的量，抑制效果越好——这⼀点和siRNA抑制的情况⼀样——唯⼀不同的是：完全匹配的结合位点（siRNA作⽤⽅式）可以单独起作⽤⽽相互不影响，⽽增加不完全配对的结合位点（注意在第⼆个实验中⽤了4个CXCR4结合位点）的个数对翻译抑制有显著的加乘作⽤。
在哺乳动物细胞中还没有到内源的siRNA，外源的siRNA介导的RNAi作⽤正是⼀种抵御机制。⽽miRNAs则⼴泛存在于哺乳动物细胞中，从理论上推测可能参与多种调控作⽤。这两种⼩东西的作⽤机制和相互关系的本质就显得更加扑朔迷离。如何在实验中正确鉴定siRNA和miRNA，甚⾄是其他的⼩分⼦RNA都成为⼀个值得关注的问题。
待解决问题
miRNAs在多个物种中⼴泛被发现，⽽且在进化上⾼度保守。这些“⼩玩意⼉”留给我们⼀⼤堆谜团：miRNA的确切功能是什么？它的⽬标靶是什么？作⽤机制是什么？也许需要对植物或者线⾍的基因组进⾏miRNAs突变株的筛选，在果蝇中可以⽤targeted-disruption缺失miRNA序列。对miRNA突变株伴随的表型缺失进⾏研究，有助于解释miRNAs的功能。
正如Phillip Zamore说的：“如果miRNAs在进化的进程中如此⾼度保守⽽没有任何实际功能，那真是⼤⾃然拿科研⼈员开涮——⽽且是⼀个残酷的玩笑”。
研究⼯具
随着⼩分⼦RNA⽇益受到研究⼈员的重视，很多研究⼩分⼦RNA的新⽅法不断推出。
分离
由于⼩分⼦RNA可能参与分化、发育、组织⽣长、脂肪代谢等⽣理过程，在不同的组织和发育阶段的表达⽔平有所不同，进⼀步了解⼩分⼦RNA的⽣物功能需要确定其在各种⽣物样品中的表达⽔平，因⽽需要⼀种精确的定量纯化⽅法，从⽽得到可信的数据。
现⾏的RNA纯化⽅法包括有机溶剂抽提⼄醇沉淀，或者是采⽤更加⽅便快捷的硅胶膜离⼼柱的⽅法来纯化RNA。由于硅胶膜离⼼柱通常只富集较⼤分⼦的RNA（200nt以上），⼩分⼦RNA 往往被淘汰掉，
因⽽不适⽤于⼩分⼦RNA的分离纯化。有机溶剂抽提能够较好的保留⼩分⼦RNA，但是后继的沉淀步骤⽐较费时费⼒。mirVana miRNA Isolation Kit是采⽤玻璃纤维滤膜离⼼柱(glass fiber filter，GFF)，既能够有效富集10mer以上的RNA分⼦，⼜能够兼备离⼼柱快速离⼼纯化的优点，是⼀个不错的选择。对于特别稀有的分⼦，由于需要分离⼤量RNA⽽导致⾼背景⽽降低灵敏度，还可以进⼀步富集10mer到200bp的⼩分⼦RNA来提⾼灵敏度。
探针制备
⽅法其实很简单：只需要准备⽬的基因的⼀⼩段寡核苷酸序列，3’端另外增加8个和T7启动⼦互补的碱基，将这段寡核苷酸和T7启动⼦引物退⽕，⽤Klenow⼤⽚断补齐得到双链的转录模版，然后⽤T7 RNA聚合酶、rNTP和标记物混合，体外转录得到标记的⼩分⼦RNA探针。这种⽅法可以快速制备各种标记（同位素、⾮放射性标记均可）的⼩于100nt的⼩分⼦RNA探针，适⽤于包括RPAs，Northerns 和原位杂交等各种⽅法检测⼩分⼦核仁RNA( small nuclear
mirna靶基因分析
RNA,snRNA)，small interfering RNA (siRNA),，micro RNA (miRNA)和 mRNA。⾮放射性标记
的探针还可以⽤于原位杂交研究miRNA或者mRNA在组织中的分布。
检测
由于⼩分⼦RNA是⼀类很⼩的分⼦，部分⼩分⼦RNA表达⽔平可能很低，因⽽需要极为灵敏⽽定量的分析⼯具。由于其分⼦很⼩，⽤RT-PCR的⽅法来定量研究⾮常困难，多数研究⼈员采⽤Northern Blots——⼀种技术复杂⽽费⼒的⽅法来检测⼩分⼦RNA的存在。传统的Northern Blot 的⽅法是是⽤探针检测固相⽀持物（膜）上的⽬标分⼦，由于⽤探针检测液相中的⽬标分⼦远⽐检测固相中的⽬标更为灵敏，⽣物通在这⾥为⼤家推荐⼀种基于核酶保护分析⽅法改进的新⽅法——将同位素标记好的⼩分⼦RNA探针和待检测样品混合杂交，未杂交的RNA和多余的探针⽤单链核酸酶消化，然后使核酸酶失活，并纯化杂交的RNA分⼦，最后通过变性胶电泳放射⾃显影检测结果。这个基于液相杂交的新⽅法不但操作简单⽽快速，⽽且灵敏度极⾼——可以半定量检测少⾄10ng总RNA模版中的⼩分⼦RNA，或者说，可以检测attomole (10-18 mol)级别的靶⽬标！灵敏度是Northern Blot的100倍。除此之外，研究⼈员还可以在同⼀个样品中同时检测多个⼩分⼦RNA和长的RNA模版。应该说，这个灵活巧妙的设计可以为从事⼩分⼦RNA实验的研究⼈员带来不少⽅便。
总⽽⾔之，⽆论是siRNA, miRNA, snRNA还是其他的⼩东西，⼩分⼦RNA研究的不断深⼊将帮助我们揭⽰更多⽣命的奥秘。
功能分析
miRNA 的上调可⽤于鉴定功能获得表型；抑制或下调可以研究功能缺失表型。
MicroRNA功能分析
上调与下调的结合可⽤于鉴定被特定miRNA 调节的基因，以及特定miRNA 参与的细胞进程。
主应⽤包括：
◇miRNA 靶定位点的鉴定和验证
◇筛选调节某个特定基因表达的miRNAs
◇筛选影响某个特定细胞进程的miRNAs
miRNA展望
编辑
miRNA在细胞分化，⽣物发育及疾病发⽣发展过程中发挥巨⼤作⽤，越来越多的引起研究⼈员的关注。随着对于miRNA作⽤机理的进⼀步的深⼊研究，以及利⽤最新的例如miRNA芯⽚等⾼通量的技术⼿段对于miRNA和疾病之间的关系进⾏研究，将会使⼈们对于⾼等真核⽣物基因表达调控的⽹络理解提⾼到⼀个新的⽔平。这也将使miRNA可能成为疾病诊断的新的⽣物学标记，还可能使得这⼀分⼦成为药靶，或是模拟这⼀分⼦进⾏新药研发，这将可能会给⼈类疾病的提供⼀种新的⼿段。
miRNA必备的知识
完整的miRNA调控的基因沉默的机制图
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