*基金项目福建省科技厅面上项目(2519JJ199)；福建省国家中医临床研究基地专项课题(JDZX25155,JDZX25152)；
福建省卫计委青年基金项目(2516-2-39)；福建省医疗“创双高”重点专科作者简介：林名瑞，男，主治医师，研究方向：脓毒症。
A 通讯作者:E-mail : Wcu. lw@ 12. com
林名瑞5陈怀宇5文丹2姚洁5李玮1△
(1.福建中医药大学附属人民医院ICU，福建福州350004；2.福建中医药大学附属人民医院急诊科，福建福州350004)
［摘要］目的 采用Small RNA 测序技术检测脓毒症小鼠2 h 脾组织mictRNA ( miRNA)的表达变化，并从非编码基因层面分析脓毒症脾功
能损伤的可能机制。 方法 将32只SPF 级健康BALB/E 小鼠随机分为对照组和脓毒症组，每组2只。脓毒症组采用LPS 1 mg/kg 腹腔注 射进行建模，对照组仅予等量生理盐水腹腔注射。两组术毕均行肌肉注射平衡液5 ml/kg ，并于术后24 h 各组随机取5只小鼠的脾组织提取
RNA ，采用Small RNA 测序技术进行miRNA 检测，然后应用生物信息学软件分析脓毒症小鼠脾组织的miRNA 表达差异及靶基因预测。 结果 小鼠建模后24 h，与对照组相比，脓毒症小鼠脾脏组织已知及未知mifNA 表达上调数分别为39个、3个，下调数分别为1个、3个。其中已 知 miRNA 表达上、下调倍数最大的前 5 个基因分别为 Rdo-miR-097-2p , mo-mir-016a-2p ,raomiR-016b-2p ,rao-miR-275-2p ,rao-mir-019b-2p o 下调 倍数前 5 的 miRNA ： Ruo-miR-133-5p , rao-miRP51a-3p , mo-miRA53-1-2p , rdo-miR-250-5p , rdo-miR-590。
结论 LPS 诱导脓毒症小鼠可出现
miRNA 表达量的改变，其上、下调倍数最显著的miRNA 可能对预测LPS 诱导的脓毒症脾功能损伤有一定指导意义。
［关键词］脓毒症；脾；microRNA
［中图分类号］R631 + .4 ［文献标识码］A ［文章编号］151 -5639(2501)51 -0503 -55
doi : 15. 3969/j. ifu. 151 - 5639.2501.61.657
Expression of microRNAs ic spleen of septir micr induced by LPS *
LIN Ming-rui ,C HEN Huai-yu , WEN Dan', YAO Jie 1 ,LI Wei A ( (. Deyartment o) Intensive Care Unit -The People ' s Hospital F
Fujian TraCitional Mebicai University,Fuzhou City,Fujian Province,324004,China ；2. Department of Emeraency,The People ' s Hospi
tal of Fujian TraCitional Mebicai University ,Fuzhou City,Fujian Province ,354004,China)
[Abstroci ] Objective To detect the expression of microRNAs in 24 h spleen tisspe of septic mice by usina Small RNA seyuencinc
technology , 5nd then to analyze the possible mechanism of spleen injury induce) by LPS from the level of
genes. Methods
Thirty SPF graCe healthy BALB/C mice were randoml/ divide) into controi eroup and sepsis group. The mice of sepsis group were
mo/eleb by inWaceritoneai injection of LPS 1 mg/kg. The controi group was given inWaceritoneai injection of the same amount of nor
mal sa/ne. The two groups receive) intramuschlar injection of 5 ml/kg balance -luib )1x 1 mo/ePng. At 24 h after suryery ,5 mice were random/ selected from each group to extract RNA from spleen tissues and then use) Smali RNA sepuencing 上©。!:—// for microRNA
detection. Bioinforma/cs software was use) to analyee microRNA expression diRerences and taryet gene prebiction in spleen tissues of sepsis mice. Reselts 24 hours )1x 1 mo/ePng,the number of up-repulation of known and unknown microRNA expression in spleen
tissues of sepsis mice was 39 and 3, and the 0(00-0X114/0/ was 12 and 3, respectivee'relative to the controi group. Among them , the
top 5 genes with the highest microRNA expression upAepuUtmn are rno-miR-216b-5p, rno-miR-375-3p , rno-miR-216b-3p , rno-miR1
217 Ap , rno-miRA 16aAp , rno-miR-133-1 -3p, rno-miR-202-5p , rno-miR-592, rno-miR-133-5p, rno-miR051 -3p. The corresponding tar get gene prebiction is Pemile) in the results section. Conclusion The miRNA expression in LPS induceX sepsis mice can be
changeX. The miRNA with the most significant up and Pown-repulation may be of guiding significance to prebict the spleen function
damage induceX by LPS.
[Kep words i Sepsis ； Spleen , MicroRNA
脓毒症是感染引起免疫系统紊乱而致机体脏器功能损
伤的一种综合征［1°］o 因其危重性、致死性强，而引起公共卫
生的关注。脓毒症可并发脾功能损伤，如脾实质充血、肿
大，嗜中性粒细胞浸润等［］。脾脏作为机体重要的免疫器 官，有清除病原体、异常血液细胞，调节T 、B 细胞等作用。 既往在脓毒症大鼠相关研究中也发现脾组织结构发生改变，
mRNA 出现明显差异表达，但有关脓毒症脾组织mmroR-
NA( miRNA )表达情况则较为鲜见。本研究拟对LPS 干预后
的小鼠脾组织进行Small RNA 测序并分析，并从非编码RNA
角度初步探讨脓毒症引起脾功能损伤的可能机制。
1材料与方法
2 1动物模型制备与分组 SPF 级BALB/C 小鼠32只，体
23
重（25 ±5）g ［购自上海斯莱克实验动物有限公司，动物合格 证号：SCXK （沪）20176005］。将小鼠随机等分成对照组和 脓毒症组，两组小鼠实验前均正常饮食、饮水。脓毒症组小
鼠按LPS 14 mg/ka （L2880）腹腔注射构建脓毒症模型，对照
组予等量生理盐水腹腔注射，术后均正常饮食、饮水。1.5脾脏组织标本采集 术后24 h 每组随机取5只小鼠， 麻醉后取部分（每组取3只小鼠）小鼠脾脏标本行病理光镜
检查，部分于冻存管液氮速冻后转-80t 冰箱保存备用，待
行Small RNA 测序。
1.3 Small RNA 测序 两组小鼠脾组织样品提取总RNA
后，使用 NanoDrop （ Thermo Scievtific ）和 Agilevt 7100 BioAna-
lyzeu （安捷伦）对每个样品的RNA 质量进行评估分析，并利
用 TruUey Rapib SR Cluster Kit 将 Flowcell 和准备好的文库，
采用mumina HiSeq2500平台产生原始测序数据。 1.0数据生物信息学分析Small RNA 测序数据的生物信
息学分析：（1）测序所得的数据进行质控（QC ），合并重复序
列、数据过滤。（7）Smal l RNA 分类：Other ncRNA ,Repeat sR- NA ,miUNA ,Map to gevome ,Unclassifief o （3）筛选 miUNA 中
的Known miUNA ，通过Map to gevome 预测新miUNA 并分析 其保守性。（4）对Known miUNA 、新miUNA 进行差异分析, 聚类分析、靶基因预测,miUNA 与靶基因网络图,miRNA-G0
网络分析,miUNA pathway 网络分析,miUNA 转录因子预测, miUNA 共表达网络分析。
2 结果
7. 1 两组小鼠脾组织病理切片HE 染结果 术后24 h，小 鼠脾组织病理切片HE 染结果显示，对照组小鼠的脾组织
结构正常，脓毒症组小鼠的脾组织可见白髓结构紊乱，红白
髓交界稍模糊，红髓稍充血。见图1。
对JS 组 J8秦症组
图1两组小鼠24 h 脾脏组织学改变情况
7.5脓毒症组小鼠脾组织差异miUNA 散点分布情况见 图2。相对于对照组，脓毒症组已知和未知功能的miUNA 上
调数分别有36个、3个，下调数分别为16个、3个。
图2两组小鼠脾组织差异miRNA 散点图
注：红f ；绿J
24
7.3脓毒症组小鼠脾组织miUNA差异表达情况见表1。表达上调39个、下调2个，未知miUNA上调和下调数分从表（可以看出，相对于对照组，脓毒症组已知miRNA别为3个。
表1腋毒症组小鼠脾组织miVNA差异表达情况
已知miRNA
序号上调miRNA下调miRNA 基因名称FC值基因名称FC值基因名称FC值
1rno-miU-152-5p 2.566371194rno-miR-216b-3p 11320212699
ruo-miR-122-5p
00450138539
2rno-miU-152-5p 2.573496113rno-miR-216b-5p 11281041074
rfo-miR-129-5p
00350978636
3rno-miU-141-5p 5.0677)3773mo-miR-217-5p 19102974633
ruo-miR-153-1-5p
00009619764
4rno-miR-1477.556512508mo-miR-217-5p 10380734688
ruo-miR-153-5p
00197900331
5rno-miR-148a-5p 2.367941412uio-miR-299a-5p 20839549728
ruo-miR-144-5p
00492987972
6rno-miR-148a-5p 20156048289
mo-miR-507-5p
53086040648
mo-miR-144-5p
0040358334
7ruo-miR-155-5p 20448451511
rc o-miR-3065-5p
64043248778
mo-miR-157-5p
00358828907
8mo-miR-155-5p 30015651259
ruo-miR-523-5p
30991329259
ruc-miR-272-5p
00021719401
9ruo-miR-155-5p 20599438864
mo-miR-5473
70139916846
ruo-miR-275
00441644279
10rno-miR-19a-5p 50408041522
ruo-miR-54a-5p
20006284972
mo-miR-5764-5p
00213021621
11ruo-miR-267a-5p 50266040342
ruo-miR-375-5p
159****4815
rc0-111：^51-5p
00209218053
12rnc-miR-277a-5p 30538464202
ruo-m iR-577b-5p
2009042372
mo-miRW66b-2-3p
0048468013
13rco-miR-207b-5p 5020876623630834479543
mo-miRW66bW-3p
0048468013
14ruo-miR-279b-5p 60221439756
mo-miRW88-5p
20307604199
ruo-miRW86
00459655167
15ruo-miR-279e-5p 20179228079
ruo-miR-532-5p
20279349589
ruo-miR-592
00152197648
16ruo-miR-21-5p 70445267694
ruo-miR-653-5p
11702928943
rco-miR-671
0042748187
17mo-miR-21-5p 30261392708
ruo-miR W62-5p
80404781785
18ruo-miR-212-5p 30268413798
ruo-miR-662-5p
71906615497
19rc o-miR-216a-3p 73004736095
rc o-miR-92a-1-5p
20915815477
20rc o-miR-216a-5p
99908160425
未知miRNA
序号上调mnRNA下调miRNA
基因名称FC值基因名称FC值
12_9464-5p(mma-miRW51b)9.33637062616__794-5p(hsc-miRW86-5p)
004833392 214_5614Wp(eca-miRW939) 2.7526618_16969-5p(hsc-miRW84)
00265118017
3X_18952-5p(hsc-miR-25a-5p)2026129887
5_12149-5p(dme-miR-16-5p)
00120756929
7.0脓毒症组小鼠脾组织差异miUNA聚类情况见图3。
相对于对照组，脓毒症组已知基因（从右CS往左SS看）：可
见部分miUNA从绿、深绿转为淡红或红，部分从淡红
或红转为绿、深绿；未知基因（从右CS往左SS看）：部
分从红转为绿，部分从绿、深绿转为红、淡红。
7.3脓毒症组小鼠脾组织差异miUNA靶基因功能富集分
析情况见图4,5。相对于对照组，脓毒症组已知差异miU-
NA：最显著的且富集差异miUNA最多的前3个通路为Vess
cU-mePiateP transport,Membrane Taffiching,InWa-Golal anf ret-
rograPe Golgi-to-PR traffic；未知差异miUNA：最显著的且富集
差异miUNA最多的前3个通路为Inositol phosphate metabo
lism, Post-translational protein1^X）111）00,6）0^01^to RAS。
图3腋毒症组小鼠脾组织差异miRNA聚类情况
25
图4已知差异miRNA靶基因功能富集情况分布图Statistics ot Pathway Enrichment
Rich F«do<
0.0已知差异miRNA靶基因预测见图6,7。上调倍数前5的miRNA有Rno-miR-317Ap,ruo-mR-dl7a-5p,ruo-miR-216b-5p,mo-miRA75Ap,mo-miR216bAp；下调倍数前5的
图5未知差异miRNA靶基因功能富集情况分布图
mnRNA有RdodmnRd138d5p edodmnRd451ad3p edodmnRd138d1 5p trnv-miR-320Ap trnv-miR-360。
图6上调倍数前5的miRNA预测靶基因情况图7下调倍数前5的miRNA预测靶基因情况
3讨论
脓毒症是重症感染引起的一种全身反应综合征，严重损害人体健康。其机制复杂，病死率高，医疗负担重而引起同行学者的广泛关注［JL E］。脓毒症可引起多器官功能损伤，脾脏是其中靶器官之一。
脾脏在机体抗感染中的作用明显，脾切除术后，凶险性感染也常有报道1921.，因此，进一步研究脓毒症相关性脾功能障碍很有必要。既往研究发现，脓毒症时脾脏出现mRNA的差异表达，可能对脓毒症脾功能损伤的发生发展有一定作用［647］。但关于上游调节机制，目前仍未明了。本研究拟从上游调节机制入手，对LPS干预小鼠脾组织miRNA表达情况进行初步分析，以其为将来研究提供方向。
本研究采用LPS诱导方法构建了小鼠脓毒症模型，发现脓毒症24h的小鼠脾脏组织白髓结构受到一定破坏，红髓、白髓交界模糊，多量组织细胞浸润，红髓充血（见图9。关于LPS诱导脓毒症小鼠模型的剂量，从9~50mg均有报道⑴25。本研究结合相关文献对LPS诱导脓毒症小鼠的剂量进行预实验，最终采用10mg/kg，观察发现在该剂量下小鼠岀现脾组织学的改变，验证了造模的成功。采用小RNA 测序技术对脓毒症小鼠脾组织miRNA进行检测，并采用生物信息学方法进行分析发现，相对于对照组，脓毒症组小鼠出现差异miRNA表达，其中已知功能的上调39个、下调9个，未知功能的上、下调数分别为5个，显示脓毒症时脾组织miRNA出现紊乱表达。从图3中可以看出，经LPS诱导的脓毒症小鼠脾组织miRNA部分区域从绿变为红，淡绿变为淡红，黑变为淡绿，红变为绿，较直观的反映LPS干预后脾脏差异miRNA表达量的变化情况。从差异miRNA （已知）靶基因功能富集分析结果中可以看出,vesicle-media-pb transport,Membrane Traffiching,Intra-Golgi and retrograhc Golgi-to-ER Paffic,COPI-depex0ext Golgi-to-ER retrograhc traf-fo这些通路差异最明显。从差异miRNA（未知）靶基因功能富集分析结果中可以看岀,Inositol phosphate memholism,Post-translational protein mobificati
on, SignaLing to RAS,hignalPng to ERKs,SignalPng to p35via RIC and RIC这些通路差异最明显。同时对已知miRNA上下调倍数前5的miRNA（上调倍数前5的miRNA:Ruo-miR-dl7Ap,ruo-mR-dl7a-5p,
ruo-miR-
216b-5p p no-miR-375-3p,J no-mim21b-3p。下调倍数前5的miRNA：Rno-miRA33-5p,rno-miR051-3p,rno-miR-133-1-3p, rno-miR-202-5p,rno-miR-592)预测靶基因预测结果(见图3、图7)。说明脓毒症可引起非编码基因表达量的改变，可能靶向调控相关基因的表达，进而影响功能蛋白表达量的改变而导致脓毒症病理生理学变化。但具体是靶向调控哪个基因的表达导致蛋白表达量的改变，有待后续进一步研究。对于差异表达上下调倍数最大的mnRNA可能对预测LPS诱导的脓毒症脾功能损伤有一定的意义。
综上所述丄PS诱导脓毒症小鼠可岀现miRNA表达量的改变，其上下调倍数最显著的miRNA(上调:rno-miR-212b-5p,rno-miR-375-3p,rno-miR-212b-3p,rno-miR-217-5p,rno1 miR-212a-5p；下调：rno-miR-133-1-3p,rno-miR-202-5p,1-003 miR-592,rno-miR-133-5p,rno-miRP51-3p)可能对预测LPS诱导的脓毒症脾功能损伤有较好的指导意义。
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25
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