一、目的与要求
(1)掌握维生素C的含量测定的原理和操作。
(2)掌握维生素C的分子式和结构简式，了解维生素C的还原性。
(3)掌握紫外分光光度法维生素C含量的测定的方法。
(4)熟悉精密紫外可见分光光度计的使用方法。
二、方法提要
维生素C（Vitamin C ，Ascorbic Acid）广泛存在于新鲜水果中，它具有保持肌肤润滑、防止衰老、抗坏血酸等作用，是人体必需的主要维生素之一，是人体正常生理代谢不可缺少的一类有机物[1]。维生素C在水果中主要以还原型（ASA）存在。维生素Ｃ又名抗坏血酸是一种
含有6个碳原子的酸性多羟基化合物，分子式为C6H8O6，分子量为。能溶于水、乙醇和甲醇，而不溶于其他有机溶剂，具有酸性和还原性，有4种异构体，即L—抗坏血酸、D—抗坏血酸、L—异抗坏血酸、D—异抗坏血酸。天然抗坏血酸主要以L—抗坏血酸为主，其效力最高。抗坏血酸在合适的条件下，可氧化成脱氢抗坏血酸，脱氢后的L—脱氢抗坏血酸在生物体内可还原为L—抗坏血酸，且这种变化是可逆的，故仍有生物活性。脱氢抗坏血酸可进一步被氧化，生成二酮古洛糖酸，而这一过程是不可逆的。在许多水果和蔬菜中，维生素C主要以还原型抗坏血酸存在。维生素C的固体较稳定，水溶性最容易受氧化，所以测定VC的准确性很大程度上取决于分析技术。 水果中VC含量的测定一般采用2,6--二氯靛酚滴定法[2]、碘量法[3]、2,4—二硝基苯肼法[4]、荧光分光光度法[5]高效液相谱法[6]和点位滴定法[7]等，这些方法都有所用试剂不稳、操作程序复杂、费时等缺点，为此，此实验采用分光光度法[8]，首先测定维生素C的标准曲线，以吸光度差值△A对抗坏血酸浓度C绘制标准曲线，以此为基础测定样品的△A，并求得水果中维生素C的含量。本方法与常规方法比较，具有准确、快速、稳定、试剂易得等优点。 维生素C是烯醇化合物，具有—C=C—基，在可见光区无吸收，在紫外区有吸收。按实验方法，分别对不同浓度的标准维生素C与试剂空白溶液在200~400nm波长范围内进行扫描， 通过吸收光谱曲线确定维生素C水溶液的最大吸收波长。又根据维生素C对碱不稳定的特性，于最大吸收波长处测定样品溶液与碱处理样品两者吸收光度之差，通过查标准维生素C的标准曲线，即可计算样品维生素C的含量。这种方法具有准确、快速、重现性好等优点，还适合深样品的测定。
由于维生素C极度不稳定，在样品前处理过程中，防止抗坏血酸的氧化是非常重要的。可采用添加偏磷酸、草酸的方法加以解决。因为它们均能抑制抗坏血酸的氧化酶，而起稳定作用。但由于2%草酸在波长200~400nm处有非常强的吸收，所以不能作为维生素C的提取液，而2%偏磷酸虽然在波长200~400nm处有微弱的吸收，可通过扣除其空白吸光值，便可计算出样品维生素C的吸光值差ΔA。因此，本实验选择2%偏磷酸作为分光光度法的溶剂。 (本实验采用紫外分光光度法)
三、试剂与仪器
（1）试剂：标准抗坏血酸溶液（mL）：精确称取抗坏血酸10mg（精确至）, 用2%偏磷酸溶解并定容至100mL，此溶液应贮存在棕瓶中，最好现配现用；
2%（W/V）偏磷酸溶液，mLNaOH，
（2）仪器：紫外—可见光光度计、石英比皿、组织捣碎机、高速离心机、50mL容量瓶、100mL容量瓶、10mL移液管、洗耳球、10mL比管、电子天平。
四、操作步骤
1、样品制备
取水果样品400 g清洗、沥干，将每份样品平均分成4份，即每份100 g，用破碎机破碎。加入%偏磷酸溶液，迅速捣成匀浆。称取 浆状样品，用%偏磷酸将样品移入100mL容量瓶中，并稀释至刻度，摇匀。有浑浊现象，用高速冷离心机离心，7500rpm，离心10min，取其上清液。
2、绘制标准曲线
吸取、、、、、抗坏血酸标准溶液，置于10mL比管中；用2%偏磷酸定容，摇匀。此标准系列抗坏血酸的浓度分别为、、、、、、、μɡ/mL。以蒸馏水为参比，在波长λmax（经
测定，最大吸收峰所对应的入射光波长λmax=245nm）处，用1cm石英比皿测定标准系列抗坏血酸溶液的吸光度。抗坏血酸吸光度为A，试剂空白吸光度为A。，计算吸光度差值△A=A—A。，以吸光度差值△A对抗坏血酸浓度C绘制标准曲线。
抗坏血酸过氧化物酶3、样品的测定
准确移取澄清透明的的提取液，置于10mL的比管中，用%偏磷酸溶液稀释至刻度后摇匀。以蒸馏水为参比，在波长λmax处，用1cm石英比皿测定其吸光度。每个样品做三次重复。
待测碱处理样溶液的测定：分别吸取澄清透明提取液，加入6滴L的NaOH溶液，置于10mL比管中混匀，在室温放置40min后，加入%偏磷酸溶液稀释至刻度后摇匀。以蒸馏水为参比，在波长λmax处，用1cm石英比皿测定其吸光度。每个样品做三次重复。
4、结果计算
由待测样品与待测碱处理样品的吸光度值之差校准曲线，即可计算出样品中维生素C的含量，也可以直接以待测碱处理液样为参比，测得待测液的吸光值，通过查校准曲线，计算
出样品的维生素C的含量。
维生素C的含量mg/100g=﹙200×C) ／﹙m×V﹚
式中： m——样品重量（g）；
200——稀释倍数；
C——从校准曲线上查得抗坏血酸的含量，μɡ/mL；
V——测试时吸取提取液体积，mL。
五、注意事项
（1）在优化的实验条件下得到的校准曲线，表明维生素C在~μɡ/mL范围内吸光度与浓度C之间呈良好的线性关系服从朗伯比尔定律。所以测定的最大吸光度值最好不要超过，否则浓度过高易造成曲线的弯曲。
（2）要求每批测定样品都要有校准曲线。
（3）在处理药品时，如遇到泡沫产生，可加入数滴辛酸消除。
（4）若样品浑浊，可用离心机分离用转速7500rpm，时间10min,至样液澄清、透明，取上清液。
（5）一般分析纯抗坏血酸纯度为99%以上，可不标定，若试剂发黄，则弃去不用。
六、思考题
1.
2.
参考资料网址
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