汪陈才
（2008 B,青海师范大学，化学系）
摘要 为建立一种有效的利用高效液相谱法（HPLC）测定冬虫夏草中虫草素和虫草酸含量的方法，用甲醇超声提取虫草素、水超声提取虫草酸，再利用高效液相谱、示差折光检测器和紫外检测器分别测定冬虫夏草中虫草素和虫草酸含量。通过对样品进行预处理，谱条件和方法指标的验证，建立了定量检测虫草中虫草素和虫草酸的一种有效方法，二者精密度( RSD) ≤1.77% 。虫草素、虫草酸检出限为50 ng/mL 和1.5 μg/mL。测得样品中虫草素和虫草酸的平均组分含量为0.258 mg·g-1和79.7mg·g-1二者回收率在93.7%～98.4%之间。该方法具有快速、准确、简便的特点。 关键字: 高效液相谱 虫草 虫草素 虫草酸
Abstract: A high performance liquid chromatographic (HPLC) with diode- array detector (DAD) and refractive index detector ( RID) method for the determination of cordycepin an
d cordycep acid in cordyceps sinensis was studied. Both of it were extracted by Methanol and water with Ultrasonic wave. Then by using high performance liquid chromatography, refractive index detector and a UV detector were measured in Cordyceps and cordycepic acid content. Based on the sample pretreatment, chromatographic conditions and method validation, establishes the quantitative detection of cordycepin and cordycepic acid is an effective method. Their precision (RSD) were lower than 1.77%. The samples of cordycepin and cordycep acid content averages are 0.258 mg•g1 and 79.7mg•g-1. Their recovery were between 91.9% and 93.7%. The method is rapid, accurate and simple features.
Key words HPLC; Cordyceps sinensis; Cordycepin; Cordycep acid
冬虫夏草(Cordyceps Sinensis)与人参、鹿茸齐名，为中国三宝之一。又名虫草、冬虫草，是麦角菌科冬虫夏草菌的子座及其寄主蝙蝠蛾科昆虫冬虫夏草蝙蝠蛾幼虫尸体的复合体[1]。其生存条件苛刻，主产于四川、青海、西藏、云南等海拔4000～5000米的高山草甸中，是我国名贵中药材[2]。由于其具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、调节免疫系统、调节心律失常、
保护肝损伤、降血糖、镇静、抗缺氧和抗疲劳等诸多功效[3]，近十多年来，我国在对冬虫夏草的资源调查、无性型确认、成分分析、临床应用及虫草产品开发等方面取得了可喜的成绩[4]。由于其资源的稀缺性和其诸多独特的药用价值，成为国内外国内外食品保健领域的研究热点。研究人员已从冬虫夏草中分离出3-去氧腺苷（虫草素）、尿嘧啶、次黄嘌呤、肌苷、鸟苷、甘露醇（虫草酸）等核苷类成分[3] 。本文利用高效液相谱测定虫草中常见的两种活性物质虫草素和虫草酸。虫草素( Cordycepin ) 是冬虫夏草有效成分之一，其分子式为C10H13N5O3, 相对分子质量为251.24 , 结构式如图1所示, 为3 - 脱氧腺苷( 3 - Deoxyadenosine ) [6]。它具有改善心脑血管循环、调节心律失常、抑制神经递质释放和调节腺苷酸环化酶活性等功效。虫草素的提取方法有回流提取法、超声波提取法等[7], 其测定方法有薄层谱法、高效液相谱法和毛细管电泳冲法等[8]。虫草酸具有抗肝组织纤维化，抗脂质过氧化，同时由于虫草的增强免疫功能使肝脏的解毒作用增强，从而能够有效保护肝细胞的作用，其结构式如图2 所示, 为D-甘露醇，相对分子质量为182.17 。虫草酸的提取方法有水提取法、醇提取法等[9]。其测定方法有容量法、光度法、高效液相谱法等[10]。
图1虫草素的结构 图2 虫草酸的结构
1 材料和方法
1.1 材料
样品：祁连产冬虫夏草, 青海省食品质量检验中心抽检产品60 目粉末。
1.2 试剂
虫草素标样, Sigma公司； 甲醇, 谱纯,山东禹王实业有限公司； 乙腈；甘露醇,谱纯, merck 公司； 超纯水, Millipore 纯水制备系统, 美国Millipore 公司。
1.3 主要仪器和设备
Waters2695高效液相谱仪，Waters2696二极管阵列紫外检测器( DAD)，Waters2414示差折光检测器，谱柱 ZORBAX SB-C18(4.6×250mm,5um)；UP3200H超声波仪（熊猫集团南京电子计量有限公司）。
1.4样品预处理
1.4.1 虫草素提取:
准确称取冬虫夏草粉末10.188 g, 虫草与甲醇料液比1∶10 ( 虫草1 g ：甲醇10 mL) , 采用超声波提取20 min , 共提取3 次；4 000 r/min 离心5 min , 取上清液, 合并3 次上清液, 浓缩并定容至25 mL。
1.4.2 虫草酸提取：
称取冬虫夏草粉末0.506 g,加水5 mL, 采用超声波提取30 min , 再静置30 min后, 将上清液以35 r/min 速度离心15 min , 定容至10 mL。
准确称取虫草素标准品,用甲醇定容, 配制成质量浓度分别为0.114、0.38、1.14、1.9、3.8μg/mL 的标准溶液。准确称取甘露醇标准样品, 用水定容, 配制成质量浓度分别为0.3 、3.19 、30.88 、81.78 、104.96 mg/mL 的甘露醇标准液,使用前现配。
1.6谱条件
虫草素：谱柱为ORBAX SB-C18柱, ( 4.6 mm×250mm, 5 μm)，柱温30 ℃。检测器为Waters2696二极管阵列紫外检测器( DAD)，检测波长260.4 nm 。流动相 V乙腈 ∶V 水 = 80 ∶20 , 流速0.8 mL/min 。用0.5 μm微孔滤膜过滤, 进样量10 μL。
虫草酸: 谱柱为ORBAX SB-C18 柱( 4.6 mm×250mm, 5 μm) , 柱温30℃。流动相 V乙腈 ∶V水 = 80 ∶20, 梯度洗脱, 流速0.8 mL/min 。检测器为Waters2414示差折光检测器。用0.5μm 微孔滤膜过滤, 进样量5 μL。
2. 结果与分析
2.1 图谱分析
在选定条件下虫草素和虫草酸标准品的高效液相谱图见图3和图5蚕蛹虫草，即虫草素在12.384min左右出峰，虫草酸在4.748min左右出峰，虫草素和虫草酸样品的谱图见图4和图6，用标准品对照法可在虫草样品图谱中出虫草素和虫草酸的相应峰的位置。
图3 虫草素标样谱图 图4 虫草酸样品谱图
图5 虫草酸标样谱图 图6 虫草酸样品谱图
2.2数据处理
2.2.1虫草素、虫草酸的标准曲线以及线性回归方程
量取虫草素标准品0.114 、0.38 、1.14 、1.9 、3.8 μg/mL 各5 mL进样分析，以峰面积为纵坐标、质量浓度为横坐标绘制标准曲线（图7）；量取虫草酸标准品0.3 、3.19 、30.88 、81.78 、104.96 mg/mL 各5 mL 进样分析，以峰面积为纵坐标、质量浓度为横坐标绘制标准曲线( 图8 ) ,线性回归方程以及线性范围见表2 。
标准质量浓度/µ g ·mL - 1 标准质量浓度m g ·mL - 1
图7 虫草素标准曲线 图8 虫草酸标准曲线
表2 虫草素和虫草酸的线性回归方程
| 线性范围 | 线性回归方程 | 相关系数R2 | 检出限 |
虫草素 | 0.114～3.8µg/mL | Y=4×106X-19681 | 0.9996 | 50ng/mL |
虫草酸 | 0.31～104.96mg/L | Y=11572X-4641.3 | 0.9999 | 1.5µg/mL |
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注：纵坐标为峰面积，横坐标为质量浓度
2.2.2 虫草素和虫草酸的组分含量及精密度
取冬虫夏草样品, 处理方法同1.4 节。将虫草素样品重复进样7 次, 利用标准曲线法分别计算虫草素和虫草酸的组分含量,利用组分含量计算精密度，其结果见表3和表4 。
组分含量计算公式如下：
V：浓缩定容后的体积；ωB:组分B的含量；m：称样量；XB：组分B的质量浓度；YB：组分B的峰面积。
标准偏差计算公式：
相对标准偏差计算公式：
表3 虫草素的组分含量及精密度(n=7)
| 虫草素样品的含量ωn：mg·g-1 | | SD/mg·g-1 | RSD/% |
虫草素 | 0.262 | 0.257 | 0.256 | 0.252 | 0.264 | 0.257 | 0.257 | 0.258 | 0.001 | 0.39 |
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表4 虫草酸的组分含量及精密度（n=7）
| 虫草素样品的含量 | | SD/mg·g-1 | RSD/% |
虫草素 | 79.3 | 78.2 | 81.6 | 78.4 | 78.5 | 80.6 | 81.1 | 79.7 | 1.41 | 0.39 |
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2.3 回收率
准确称取冬虫夏草3 份, 按1.4 节方法处理样品,分别加入不同浓度的虫草素，定容后进样检测；准确称取冬虫夏草3 份, 按1.4 节方法处理样品, 分别加入不同量的虫草酸,定容后进样检测, 结果见表5 。
表5 回收率实验结果
成分 | 理论加入量/mg | 实际测定值/mg | 回收率/% | 平均回收率/% |
虫草素 | 0.5 | 0.48 | 96.0 | 93.7 |
| 1.0 | 1.11 | 90.1 |
| 2.0 | 1.9 | 95 |
虫草酸 | 4.0 | 3.7 | 92.5 | 98.4 |
| 8.0 | 6.9 | 86.3 |
| 20.0 | 23.3 | 116.5 |
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3 讨论
3.1 虫草素的提取方法
虫草素的提取方法有醇回流、水回流、醇超声、水超声等方法。回流法耗时过长, 对温度的要求高, 操作较为繁琐, 提取效果一般。采用索氏抽提法和超声法提取虫草素, 可获得相近的结果, 但超声提取法更为快捷、简便且准确度高, 操作自动化程度高, 受试验环境、温度的影响小。由于虫草素的醇溶性较好, 甲醇能快速渗透到细胞内, 故选用甲醇超声波提取法提取虫草素。
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