作者：肖蓉 张春芬 邓舒
来源：《果树资源学报》2021年第01期
摘要：研究利用Illumina Miseq高通量测序技术，比较新茬草莓和连作3年草莓根际土壤细菌、真菌落多样性，旨在了解其微生物落生态特征，为防治连作障碍奠定基础。结果：重茬3年后土壤中细菌物种多样性及丰富度降低;新茬土壤中丰度最高的鞘氨醇单胞菌被节杆菌属取代，肠杆菌属丰度显著升高。对于真菌来讲，重茬3年后土壤中真菌物种多样性和丰富度增大;新茬土壤中含有植物病原菌链格孢菌和茎点霉菌，重茬3年后枝顶孢属、被孢霉属、镰刀菌属等病原菌大量积累。结论：重茬土壤中细菌多样性降低、真菌多样性增高，病原真菌积累是引起草莓连作障碍的主要原因。
关键词：重茬;高通量测序;多样性分析;草莓
文章编号：2096-8108（2021）01-0028-06中图分类号：S668.4文献标识码：A
Abstract：In order to understand the ecological characteristics of rhizosphere soil microbial communities for strawberry’s continuous obstacle controlling， the diversity of bacteria and fungi communities of newly cropped strawberry and continuously cropped strawberry for 3 years by high-throughput sequencing were compared. The results showed that the diversity and richness of bacterial in the soil decreased after continuous cropping. Sphingomonas with the highest abundance in new soil was replaced by Arthrobacter， and Enterobacter abundance increased significantly. For fungi， the diversity and richness increased after continuous cropping. There were Alternaria and Phoma in the new soil. But after 3 years of continuous cropping， a large number of other phytopathogens were accumulated such as Acremonium， Mortierella and Fusarium. In conclusion， the decrease of bacterial diversity， the increase of fungal diversity and the accumulation of pathogenic fungi in the soil were the main causes of strawberry continuous cropping obstacles.
Keywords：continuous cropping;high-throughput sequencing;diversity analysis;strawberry
生产中大棚草莓种植每年都要换新苗，因此重茬在所难免。连作障害是制约草莓发展的最大因素，据调查，连作4年草莓能减产40%以上[1]。目前，大家公认的连作障害的形成机理主要包括连作土壤中病原微生物积累[2]、土壤营养元素失衡[3]、化感作用[4-6]3个方面。而土壤微生态失衡是研究者所公认的连作障害发生的根本。其中微生物因素在整个连作障碍发生发展过程中一直扮演着关键角。
在土壤这个黑匣子中到底有多少微生物，以及他们之间的结构信息、体相互作用、与植物重茬障碍之间的关系等等吸引着人们持续而深入的研究。由于目前土壤中可培养的微生物仅占土壤微生物总数的1%左右，因此依赖于平板培养技术来研究土壤微生物生态显然是不够的[7]。近些年来，随着现代生物技术和基因组学的蓬勃发展，以土壤中全部微生物基因组DNA序列为依据的微生物分子生态学研究方法正日益成为大家普遍接受的方法[8]。
本研究以同一个农业园区新茬草莓大棚和连作3年的重茬草莓大棚土壤为研究对象，
直接提取草莓根际土壤总DNA，通过Illumina Miseq测序平台对新茬土壤及重茬土壤细菌和真菌结构及功能多样性进行比较分析，旨在到重茬土壤中的优势细菌和真菌类，从微生物生态学角度研究草莓重茬障害发作时的生物学病因，为草莓重茬障碍防治提供理论依据。
1材料与方法
1.1供试土样
土壤样品采自山西省太原市阳曲县同一个农业园区新茬草莓大棚和连作3年的重茬草莓大棚，于6月草莓刚收获结束后采样。每个大棚内按“S”形于大棚中间随机挑选草莓植株4株，整株挖出置于冰盒中用无菌袋带回实验室，抖掉根部多余的土后用无菌毛刷刷取根际土，4个土样混合成1个样置于无菌离心管中，新茬土壤样品命名为XJS1，重茬土壤样品命名为CJS1。各类型选取4座大棚為采样地，共获得XJS1和CJS1样本各4个，视为4次重复。
1.2土壤微生物总DNA提取及测序
土壤微生物总DNA提取方法参考本课题组前期方法[9]。用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性后用Nanodrop 2000分光光度计测定其浓度，DNA合格样品送生工生物工程（上海）股份有限公司完成后续多样性测序工作。细菌多样性测序选取V3-V4区作为靶向扩增区域，真菌多样性测序选取ITS1-ITS2区作为靶向扩增区域。
1.3数据处理与分析
采用Excel软件对各样本丰富度进行分析。
2结果与分析
2.1细菌多样性分析
2.1.1多样性指标
原始测序数据通过质控后，新茬大棚土壤（XJS1）中共获得33 198条序列，分归于24 968个OTUs;3年重茬大棚土壤（CJS1）中共获得29 399条序列，分归于23 307个OTUs。表1展示了两种大棚土壤的细菌多样性，可见，新茬大棚土壤的Shannon指数为8.0
92 6，Simpson指数为0.001 6，Chao-1指数为24 863;重茬大棚土壤的这3个多样性指数分别为7.583 1、0.008 7和23 415。Shannon指数常用来综合体现物种丰富度和均匀度;Simpson指数被用来评估环境中微生物多样性，其数值越大代表样本落多样性越低;Chao-1指数在生态学中也是估计物种种数的常用指标。根据OTUs数目及多样性指标可以看出，重茬3年后土壤中细菌物种多样性及丰富度降低。
2.1.2门水平上丰富度差异分析
经过软件RDP classifier处理后，对所有序列进行细菌落分类。新茬土壤中共涉及到29个门，重茬土壤中共涉及到25个门。图1和图2是两种土壤类型中的优势细菌在门水平的丰度占比分布图。可知，未分类的细菌（Unclassified），在两种生境中均占比很大，分别占17.04%和24.48%，说明土壤中还有许多未可培养的细菌。除了这类细菌外，变形菌门（Proteobacteria）在两种生境中均是丰度第一的优势细菌，在新茬土壤中与重茬土壤中丰度分别占51.39%和50.44%;其次是拟杆菌门（Bacteroidetes），分别占17.09%和13.21%;另外，疣微菌门（Verrucomicrobia）、厚壁菌门（Firmicutes）、浮霉菌门（Planctomycetes）和疣微菌门（Verrucomicrobia）在两种生境中的丰度值均高于1%。
新茬土壤中丰度值高于1%的还有酸杆菌门（Acidobacteria，2.23%）和绿弯菌门（Chloroflexi，1.21%）。其余各类所占比例较少。
firmicutes
2.1.3属水平上上丰富度差异分析
从属水平看，新茬土壤中共涉及到831个属，丰度值高于1%的属有17个。重茬土壤中共涉及到817个属，丰度值高于1%的属有15个。说明新茬土中细菌多样性高于重茬土。图3展示了新茬土壤与重茬土壤优势细菌类丰度分布。可见，在各属上，两种生境中丰富度含量也有差异：在新茬土中，丰度最高的前3位是鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）、根瘤菌（Rhizobium）、假单胞菌（Pseudomonas），丰度值分别占6.16%、5.28%、4.91%;在重茬土中，丰度最高的前3位是节杆菌（Arthrobacter）、Olivibacter、根瘤菌，丰度值分别占16.22%、8.20%、6.14%。与新茬土相比，重茬土中鞘氨醇单胞菌、地杆菌（Pedobacter）和Skermanella丰度显著降低，分别由6.16%、4.78%和4.26%降低为2.33%、0.09%和0.66%;重茬土中节杆菌和肠杆菌（Enterobacter）丰度显著升高，分别由4.78%、1.34%升高为16.22%、5.86%。
2.2真菌多样性分析
2.2.1多样性指标
新茬大棚土壤中共获得23 377条序列，分归于795个OTUs;3年重茬大棚土壤中共获得22 484条序列，分归于881个OTUs。表2展示了两种大棚土壤的真菌多样性指数，可见，重茬3年后土壤中真菌类OTU数量、Shannon指数、Chao1指数均升高，Simpson指数降低，表明重茬3年后土壤中真菌物种多样性增大。
2.2.2门水平上丰富度差异分析
从门水平上看，新茬土壤与重茬土壤中分别检测到26.87%和5.69%的unclassified和unclassified-Fungi，说明两种生境中均含有较多的未知菌，但相对而言，重茬土壤中未知菌较少。除此之外，子囊菌门（Ascomycota）为两种生境中的第一优势菌，新茬土壤中与重茬土壤中丰度分别占61.14%和72.60%;新茬土壤中丰度排名第二的为担子菌門（Basidiomycota），占11.36%，该菌在重茬土壤中丰度占比下降为8.57%;两组差异较大的菌为接合菌门（Zygomycota），该菌在新茬土壤中含量很低，丰度仅占0.54%，但重茬3年后的土壤中该菌丰度快速增长至13.08%。
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