张鑫，青格尔，高聚林，等.玉米秸秆低温降解复合菌的筛选及其菌种组成[J].农业环境科学学报,2021, 40（7）：1565-1574.ZHANG X,Qinggeer,GAO J L,et al.Screening and composition of the microbial consortium with corn straw decomposition under low temperature[J].Journal of Agro-Environment Science ,2021,40（7）：1565-1574.
开放科学OSID
玉米秸秆低温降解复合菌的筛选及其菌种组成
张鑫1，青格尔1，2，高聚林1，2*，于晓芳1，2*，胡树平2，4，张必周1，韩升才2，3，冯彪1
（1.内蒙古农业大学农学院，呼和浩特010019；2.内蒙古自治区作物栽培与遗传改良重点实验室，呼和浩特010019；3.内蒙古农业大学园艺与植保学院，呼和浩特010019；4.内蒙古农业大学职业技术学院，包头014100）
Screening and composition of the microbial consortium with corn straw decomposition under low temperature
ZHANG Xin 1,Qinggeer 1,2,GAO Julin 1,2*,YU Xiaofang 1,2*,HU Shuping 2,4，ZHANG Bizhou 1,HAN Shengcai 2,3,FENG Biao 1
（1.Agricultural College,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010019,China;2.Key Laboratory of Crop Cultivation and Genetic Improvement in Inner Mongolia Autonomous Region,Hohhot 010019,China;3.Horticulture and Plant Protection College,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010019,China;4.Vocational and Technical College,Inner Mongolia Agricultural University,Baotou 014100,China ）
Abstract ：To promote in-situ corn straw decomposition in cold northern regions,this study screened the microbial consortium with corn straw degradation under low temperatures.Fifty-seven bacterial source samples from different areas of Inner Mongolia were selected as screening objects by enrichment culture in a low temperature （15℃）subculture with corn straw as the carbon source,and using the straw degradation rate and enzyme activity of different cultures as screening indexes.The compound strains with high efficiency in degrading corn straw were selected.The degradation characteristics and microbial community diversity of complex strains were determined.The results
收稿日期：2021-01-14录用日期：2021-05-10作者简介：张鑫（1994—），女，内蒙古通辽人，博士研究生，从事寒旱区作物生理生态研究。E-mail ：zhangxin_9409@163
青格尔与张鑫同等贡献
*通信作者：高聚林E-mail ：nmgaojulin@163 ；于晓芳E-mail ：yuxiaofang75@163 基金项目：国家自然科学基金项目（32060434,31760353）；国家重点研发计划项目（2017YFD0300804，2018YFD0300401）；内蒙古自然基金项目
（2020MS03086,2018ZD02）；国家玉米产业技术体系项目（CARS-02-63）；农业部华北黄土高原地区作物栽培科学观测实验站项目（25204120）
Project supported ：The National Natural Science Foundation of China （32060434,31760353）;The National Key R&D Program of China
（2017YFD0300804,2018YFD0300401）;The Inner Mongolia Natural Foundation （2020MS03086,2018ZD02）;The Maize Industrial Technology System Construction of Modern Agriculture of China （CARS-02-63）;The Crop Science Observation and Experiment Station in Loess Plateau of North China of Ministry of Agriculture （25204120）
摘要：为筛选适用于北方高寒区玉米秸秆低温降解的复合菌系，促进还田玉米秸秆原位腐解，本研究以内蒙古不同地区采集的 57份菌源样品为材料，采用富集培养方法和以玉米秸秆为碳源的低温（15℃）继代培养技术，以不同培养代数秸秆降解率和酶活
性为筛选指标，选择高效降解玉米秸秆的复合菌系，并明确其玉米秸秆降解特性及菌种组成多样性。结果表明：57份菌源材料经多层次递进式筛选后获得3个玉米秸秆低温高效降解复合菌系，编号分别为M44、M14和M2，15℃培养20d 后，玉米秸秆降解率分别为35.33%、33.34%和31.33%。其中M44的玉米秸秆降解率较对照（GF-20）高12.25%，秸秆组分中半纤维素和木质素降解率分别较对照高5.47%和23.13%；滤纸酶、内切葡聚糖酶、木聚糖酶和漆酶的活性较对照分别高7.41%、1.44%、13.85%和17.88%。由高通量测序可知，Proteobacteria 、Firmicutes 和Bacteroidetes 为各菌系中的优势菌门，M44中的优势属为Trichococcus 、Acinetobacter ；M14主要由Azospirillum 、Enterococcus 组成；M2主要由Delftia 、Sphingobacterium 组成。综上所述，以玉米秸秆为碳源筛选获得的复合菌系M44在低温（15℃）条件下具有高效降解玉米秸秆的能力。关键词：低温；玉米秸秆；复合菌系；降解特性；菌种组成中图分类号：X172；X71 文献标志码：A
文章编号：1672-2043（2021）
07-1565-10
doi:10.11654/jaes.2021-0057
作物秸秆是一种高效、经济、具有丰富营养元素的可再生有机资源[1]。据统计，我国作物秸秆年产量近8.5亿t，其中玉米秸秆产量最大，约为2.8亿t[2-3]，有研究表明，长期秸秆还田可以增加土壤有机碳，改善土壤理化性质[4]；秸秆还田还可以使秸秆中的矿质营养返还到土壤中，促进养分平衡[5]，但秸秆中含有纤维素、半纤维素、木质素等物质形成的坚固复杂的组织，使秸秆天然降解难度高[6-7]。我国北方地区低温持续时间长，大量农作物秸秆未能得到及时有效的利用，造成资源的浪费[8]。目前，木质纤维素类物质的处理方法主要有物理方法、化学方法和生物降解，其中生物降解具有降解率高、安全环保、成本低、可再生等优点。因而，微生物降解技术成为提高低温地区还田玉米秸秆快速、高效腐解的有效措施之一[9-10]，而筛选低温玉米秸秆降解菌是添加外源微生物促进秸秆原位腐化的关键。自然界中广泛存在具有高效降解木质纤维素酶系统的微生物，如王春芳等[11]以堆肥为菌源采用外淘汰方法获得的复合菌系F1在40℃条件下培养10d后秸秆总降解率为52.55%，其中Bacillus、Pet⁃rimonas、Pusillimonas为秸秆降解关键物种；WANG 等[12]从芦苇池塘污泥中获得的复合菌系LDC培养15
d后，芦苇秸秆木质素降解率达60.9%，半纤维素降解率达43.0%；苏鑫等[13]通过限制性富集培养技术从腐烂芦苇秸秆根部土壤中筛选获得木质素降解复合菌系LDC，在32℃条件下培养7d，木质素最大降解率为44.5%，其优势菌种为Pseudomonas、Pannonibacter、Thauera。
本团队长期从事玉米秸秆低温高效降解微生物筛选研究，前期筛选出的复合菌系GF-20以滤纸作为碳
源进行筛选，玉米秸秆降解率达32.29%[14]，具有良好的稳定性[15]，对纤维素和半纤维素降解效果较好，但对木质素组分的降解效果不理想。且内蒙古地区
秋冬季气温低，周期长，中高温菌及其酶的应用受到了较大限制，因此本研究在前人研究基础上，将玉米秸秆作为碳源，以内蒙古不同地区多年秸秆还田土壤、牛羊粪等菌源样品为材料，经多层次递进式筛选获得玉米秸秆低温高效降解菌系，并对获得的复合菌系进行玉米秸秆降解效率和菌种组成多样性分析，旨在为原位还田玉米秸秆低温腐解提供功能菌系，促进玉米秸秆的合理利用及耕地保护和生态安全，实现农业废弃物秸秆的资源化利用和农业可持续发展。
1材料与方法
1.1试验材料
试验于2018—2019年在内蒙古农业大学玉米中心微生物实验室（内蒙古自治区包头市土默特右旗沟门镇）进行。供试菌源样品为实验室4℃下保存的采集自内蒙古自治区呼伦贝尔、兴安盟、通辽和赤峰地区多年秸秆还田土壤、牛羊粪、森林腐殖质等57份菌源材料，供秸秆降解菌的筛选。对照复合菌GF-20为本团队以简单纤维素材料滤纸为碳源筛选获得的低温降解菌，主要由Cellvibrio mixtus subsp.、Azospira oryzae、Arcobacter defluyii、Bacillus sp.等组成，10℃下培养15d秸秆降解率为32.29%[14]。
玉米秸秆取自内蒙古农业大学玉米中心试验田（内蒙古自治区包头市土默特右旗沟门镇北只图村）收获的玉米秸秆（纤维素、半纤维素和木质素含量分别为53.46%、27.32%和11.71%），挑选粗细、大小适中的玉米秸秆，取回后用流水冲洗干净，在65℃的烘箱中烘至恒质量，烘干后的玉米秸秆再剪成2~3cm 的小段，灭菌备用。
1.2培养基
基础培养基（AO培养基）：尿素0.2g、（NH3）2SO4 0.8g、K2HPO40.5g、CaCO31.0g、NaCl0.1g、MgSO4
57materials using the multi-level progressive method.The corn straw degradation rates of M44,M14,and M2were35.33%,33.34%,and 31.33%at15℃for20d,respectively.Among the corn straw degradation rates,that of M44was12.25%higher than that of the control（GF-20）;the hemicellulose and lignin degradation rates of straw were5.47%and23.13%higher than those of the control,respectively.The activities of filter paper enzyme,endoglucanase,xylanase,and laccase were7.41%,1.44%,13.85%,and17.88%higher than those of the control,respectively.High-throughput sequencing revealed that Proteobacteria,Firmicutes,and Bacteroidetes were the dominant phyla in all consortia.M44and M14were predominantly composed of Trichococcus,Acinetobacte,Azospirillum,
and Enterococcus.M2was mainly composed of Delftia and Sphingobacterium.From this analysis,it is conclude that the compound strain M44obtained using corn straw as a carbon source can effectively degrade corn stalks at low temperatures（15℃）.
Keywords：low temperature;corn straw;microbial consortium;degradation characteristics;microbial composition
蛋白胨纤维素培养基（PCS 培养基）：蛋白胨5.0
g 、酵母粉5.0g 、NaCl 5.0g 、CaCl 22.0g 、K 2HPO 40.5g 、MgSO 4·7H 2O 0.5g 、1L 蒸馏水，pH 值6.7。
Mandels 培养基（M 培养基）：K 2HPO 43.0g 、
NaNO 33.0g 、CaCl 20.5g 、MgSO 4·7H 2O 0.5g 、Fe 2SO 4·7H 2O 7.5mg 、MnSO 4·H 2O 2.5mg 、ZnSO 42.0mg 、CoCl 23.0mg 、1L 蒸馏水，pH 值6.8。
产酶培养基：尿素0.6g 、蛋白胨0.5g 、（NH 3）2SO 4
2.0g 、K 2HPO 41.0g 、MgSO 4·7H 2O 0.05g 、MnSO 4·7H 2O 0.016g 、ZnSO 4·7H 2O 0.017g 、CaCl 20.02g 、NaCl 0.2g 、
蒸馏水1L 。
于100mL 三角瓶中加入40mL 培养液和1.0g 玉米秸秆，121℃灭菌20min ，备用。1.3试验设计1.3.1复合菌系的筛选
初筛：分别称取2g 菌源样品接种到装有玉米秸
秆的M 培养基、PCS 培养基和AO 培养基中，置于
20℃恒温培养箱中进行富集培养，当三角瓶中液体变浑浊、玉米秸秆出现腐解现象时开始转接，如此转接2代。
复筛：吸取F2代培养液按5%（V /V ）的接种量重新转接到M 培养基、PCS 培养基和AO 培养基中，且秸秆降解表现稳定时每转接一代温度降低1℃，直至降低到15℃。在限制性继代培养低温驯化过程中，淘汰分解能力减弱的样品，如此连续培养8代。根据不同培养代数秸秆降解率判断复合菌系秸秆降解能力，选取降解效果好的复合菌系进行下一步研究。
1.3.2复合菌系玉米秸秆降解性能检测
将复筛获得的复合菌系以5%（V ∶V ）的接种量接
入产酶培养基和M 培养基中，在15℃恒温条件下静置培养，第1、5、10、15、20d 测定纤维素、半纤维素、木质素酶活性以及玉米秸秆降解率及木质纤维素降解率，明确复合菌系降解特性。1.4测定指标与方法1.4.1酶活性的测定
将复合菌系接种于产酶培养基中，15℃下分别
在培养第1、5、10、15、20d 时取各复合菌系发酵液10mL ，4℃、5000r·min -1条件下离心10min ，取上清液
（粗酶液）5mL ，测定酶活性。采用《纤维素酶制剂》（QB/T 2583—2003）中DNS 法测定滤纸酶活性和内切-1，4-β-葡聚糖酶活性；采用《饲料添加剂木聚糖酶活力的测定分光光度法》（GB/T 23874—2009）中DNS 法测定木聚糖酶活性；采用ABTS 法[16]测定漆酶的活性，藜芦醇法[16]测定木素过氧化物酶活性，3次重复。1.4.2玉米秸秆降解率的测定
接种后第1、5、10、15、20d 取出秸秆，用水洗净，
于65℃烘箱中烘干至恒质量，采用下列公式计算玉米秸秆降解率，3次重复。
W 2=（W 0-W 1）/W 0×100%
式中：W 0为接种前培养基中的秸秆质量，g ；W 1为培养结束烘干后降解剩余的秸秆质量，g ；W 2为玉米秸秆降解率，%。
1.4.3玉米秸秆木质纤维素含量的测定
接种后第1、5、10、15、20d 取出秸秆，用蒸馏水洗
净，将降解后的秸秆烘干粉粹后过1mm 筛，采用纤维素分析仪（ANKOM A200i ）测定木质素、纤维素、半纤维的含量，并计算木质纤维素降解率，3次重复。1.4.4复合菌系微生物组成多样性分析
将供试菌系15℃静置培养21d 后取发酵液5
mL ，4℃、5000r·min -1离心10min ，弃上清液，留沉淀，如此反复多次，确保已完全沉淀，后交由上海美吉生物医药科技有限公司进行16S rRNA 基因测序，PCR 引物为338F （5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-
3′）和806R （5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′），GF-20由北京奥维森基因科技有限公司完成MiSeq 高通量测序[15]。1.5数据处理
理化特性数据采用SPSS 22.0软件进行方差分
析，采用SigmaPlot 12.5作图。微生物菌种组成测序数据采用RDP classifier 贝叶斯算法（Version 2.2，http ：//source forge/projects/rdp-classifier/），在Qi⁃ime 平台（http ：// /scripts /assign_taxonomy.ht⁃ml ）下，以0.7为置信度阈值，将OTU 代表序列与Silva 数据库（Release128，http ：//www.arb-silva.de ）进行比对，获得OTU 代表序列的分类学信息。
2结果与分析
firmicutes2.1玉米秸秆低温高效降解复合菌系的筛选
57份菌源材料经富集培养和初筛，获得22份可
高效降解玉米秸秆的材料，并对其进一步低温驯化和限制性培养后，获得9份降解玉米秸秆的复合菌系，分别为M44、M14、M2、P22、A14、M1、M36、M38和M55。
系M44、M14和M2在各培养代数中秸秆降解率均显著高于其他菌系，15℃培养20d ，F11代秸秆降解率分别为34.89%、34.77%和34.44%。培养至F9、F10和F11代时，菌系M44、M14和M2的秸秆降解率趋于稳定，各代数降解率无显著差异。各复合菌系酶活性如表1所示，复合菌M44的内切葡聚糖酶活性为1.90
U·mL -1，与M14和M2无显著差异，但显著高于其他菌系；滤纸酶活性表现为M44、M14、M2、P22间无显著差异，但均显著高于除A14外的其他菌系，酶活性分别为2.74、2.44、2.43U·mL -1和2.58U·mL -1；木聚糖酶活性表现为M44、M14、M2、P22、M1和M36间无显著差异，但与M38差异显著，其中M44酶活性最高，为10.40U·mL -1；漆酶的活性表现为M44与M14间差异不显著，但均显著高于除P22外的其他菌系，酶活性分别为57.19U·L -1和61.77U·L -1；木素过氧化物酶活性表现为P22和M14显著高于其他菌系，酶活性分
别为97.16U·L 和93.71U·L 。
根据秸秆降解率及酶活性指标进行复筛，对复合菌系M44、M14和M2进一步分析，并以团队之前筛选获得的复合菌系GF-20为对照。供试菌系来源见表2。
2.2复合菌系酶活性动态分析
2.2.1复合菌系滤纸酶、内切葡聚糖酶活性动态
由图2可知，各复合菌系纤维素酶活性均随培养
时间呈先升高后降低的单峰曲线变化。其中，各复合菌系滤纸酶活性在培养5d 或10d 时达到峰值，M44的最高酶活性显著高于其他菌系，为2.53U·mL -1，较GF-20高出6.72%。在培养5d 时复合菌系M44和GF-20的内切葡聚糖酶活性均表现最高，酶活性分别
为2.33U·mL -1和2.29U·mL -1，无显著差异。2.2.2复合菌系木聚糖酶活性动态
由图3可知，各复合菌系木聚糖酶活性呈先升高
图1复合菌系不同代数玉米秸秆降解率
Figure 1The corn straw degradation ratio of complex strains in different algebraics
表1复合菌系酶活性分析
Table 1Enzyme activity analysis of complex strains
注：表中数据是平均数±标准误差，同列不同小写字母表示差异显著（P <0.05）。下同。Note ：Data in the table are represented with mean±SE.Different letters indicate significant differences at P <0.05level.The same below.
复合菌系Complex strains
M44M14M2
P22A14M1M36M38M55
内切葡聚糖酶活性Endoglucanase activity/
（U·mL -1）
1.90±0.09a
1.79±0.20ab 1.70±0.16abc
1.55±0.03cd 1.40±0.16d 1.50±0.11cd 1.58±0.10bcd
1.52±0.05cd 1.46±0.14d 滤纸酶活性Filter paper enzyme activity/（U·mL -1）
2.74±0.13a
2.44±0.11abc 2.43±0.08abc 2.58±0.20ab 2.13±0.13bcd 1.90±0.34de 1.61±0.38e 1.81±0.37de 1.99±0.22cde
木聚糖酶活性
Xylanse activity/（U·mL -1）10.40±2.69a
8.76±0.96abc 9.52±1.17ab 9.71±3.70ab 6.18±1.44bcd
7.71±0.29abcd 8.63±0.37abc 4.60±0.88d
5.49±1.12cd 木素过氧化物酶活性Lignin peroxidase activity/
（U·L -1）
88.27±1.96b 93.71±3.29a 76.19±2.19c 97.16±1.37a
65.83±4.74d 76.10±3.85c 70.85±3.02cd 51.20±2.98e 36.94±2.65f 漆酶活性Laccase activity/（U·L -1）57.19±3.65ab 61.77±4.75a
50.66±3.67cd 54.41±4.20bc
46.50±4.13d 44.91±3.98d 50.39±1.11cd
36.83±3.69e
38.04±1.94e 玉米秸秆降解率
T h e r a t i o o f c o r n s t r a w d e g r a d a t i o n /%
40.035.030.025.010.0M44
M14M2P22A14M1M36M38M55
培养代数Cultivation algebra
不同小写字母代表各菌系间差异显著。下同
Different lowercase letters indicate significant differences among strains.The same below
后降低的单峰曲线变化。在培养5d 时，各复合菌系达到最高值，其中复合菌M44的木聚糖酶活性最高，为4.08U·mL -1，较GF-20高13.97%。2.2.3复合菌系漆酶活性动态
各复合菌系漆酶活性如图4所示，漆酶活性与木
聚糖酶活性变化一致。酶活性于培养第5d 时达到峰值，复合菌M44、M14和M2漆酶活性分别为126.94、117.82、113.28U·L -1，其中，复合菌M44酶活性较GF-20高17.88%，且差异显著。2.3复合菌系玉米秸秆降解特性变化动态2.3.1复合菌系玉米秸秆降解率变化动态
各复合菌玉米秸秆降解率如图5所示，随培养时间的增加，秸秆降解率呈增加趋势，各复合菌系从培养1d 到5d 的秸秆降解率增幅最大，培养5d 后降解速率减缓。培养20d 时，复合菌M44、M14、M2和GF-20的秸秆降解率分别为35.33%、33.34%、31.33%和31.48%，M44降解率较GF-20显著高出3.85个百分点。2.3.2复合菌系木质纤维素降解率变化动态
由图6可知，随着玉米秸秆的分解，各复合菌系
的木质纤维素组分含量逐渐降低，且纤维素降解率显d ，GF-20表2供试菌系来源Table 2Strains collecting site
编号Number
M2
M14M44GF-20来源Source 草原草甸土鲜牛粪风干羊粪
15a 连续玉米秸秆还田土
采集地点Sampling position
兴安盟突泉县呼伦贝尔陈巴尔虎旗呼伦贝尔陈巴尔虎旗
吉林省长春市
年平均气温Average temperature/℃
0~7
-5~2-5~24.8图2复合菌系滤纸酶、内切葡聚糖酶活性动态
Figure 2Dynamics of filter paper enzyme and endoglucanase activity of complex strains
图3复合菌系木聚糖酶活性动态
Figure 3Dynamics of xylanase activity of complex strains
图4复合菌系漆酶活性动态
Figure 4Dynamics of laccase activity of complex
strains
滤纸酶活性
F i l t e r p a p e r e n z y m e a c t i v i t y /（U ·m L -1）
时间Time/d
内切葡聚糖酶活性
E n d o g l u c a n a s e a c t i v i t y /（U ·m L -1）
时间Time/d
M44
M14
M2
GF-20
木聚糖酶活性X l y a n a s e a c t i v i t y /（U ·m L -1）
时间Time/d
漆酶活性L a c c a s e a c t i v i t y /（U ·L -1）
时间Time/d
140.0120.0100.080.060.040.0
分点，显著高于其他菌系；M44和GF-20处理的秸秆半纤维素降解率分别为30.34%和28.77%，高于菌系M14和M2；菌系M44处理的木质素降解率增加了
14.63个百分点，较GF-20高3.28个百分点，且差异显著。
2.4复合菌系微生物落多样性和结构组成差异分析由玉米秸秆降解特性数据可知，筛选驯化所得的
复合菌具有较强的玉米秸秆降解能力，为了进一步明确该复合菌系的优势菌种，对其进行微生物组成多样性分析，结果如图7所示。基于门分类水平（Others<1%），各复合菌系的细菌落主要隶属4个门，分别为Proteobacteria （变形菌门）、Firmicutes （厚壁菌门）、Bacteroidetes （拟杆菌门）和Actinobacteria （放线菌门）。其中，Proteobacteria 是菌系中最丰富的细菌类，在M44、M14、M2和GF -20中相对丰度分别为
图5复合菌系玉米秸秆降解率变化动态
Figure 5Dynamics change of corn straw degradation ratio of complex strains
图6复合菌系木质纤维素降解率变化动态
Figure 6Dynamics change of lignocellulosic degradation ratio of
complex strains
图7门分类水平上复合菌系细菌的落组成Figure 7The community composition of complex bacteria at
phylum
level
玉米秸秆降解率C o r n s t r a w d e g r a d a t i o n r a t i o /%
时间Time/d
纤维素降解率C e l l u l o s e d e g r a d a t i o n r a t i o /%
时间Time/d
半纤维素降解率H e m i c e l l u l o s e d e g r a d a t i o n r a t i o /%
时间Time/d
木质素降解率L i n g i n d e g r a d a t i o n r a t i o /%时间Time/d
20.016.012.08.04.00M44
M14
M2
GF-20
相对丰度R e l a t i v e a b u n d a n c e /%
复合菌系Complex strains
其他Others
疣微菌门Verrucomicrobia 拟杆菌门Bacteroidetes 变形菌门Proteobacteria 螺旋体门Spirochaetes 放线菌门Actinobacteria 厚壁菌门Firmicutes
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