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㊀2021Vol.47No.7(Total 427)
DOI:10.13995/jki.11-1802/ts.025561
引用格式：邓祥宜，李继伟，何立超，等.宣恩火腿发酵过程中表面微生物落演替规律[J].食品与发酵工业,2021,47(7): 34-42.DENG Xiangyi,LI Jiwei,HE Lichao,et al.Microbial community succession pattern on the surface of Xuanen ham during fermentation[J].Food and Fermentation Industries,2021,47(7):34-42.
宣恩火腿发酵过程中表面微生物落演替规律
邓祥宜，李继伟，何立超，张原源，黄国威，鲍晓龙，邱朝坤∗
(武汉设计工程学院食品与生物科技学院，湖北武汉,430205)
摘㊀要㊀为揭示宣恩火腿发酵过程中微生物落演替规律，运用高通量测序技术分析不同发酵时间火腿
表面细菌和真菌落组成，并对物种相关性和微生物落功能进行分析㊂结果表明：宣恩火腿表面细菌落多样性在发酵过程中持续增加，共检出11个门和96个属；发酵前㊁中期，木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)占绝对优势(>98%)，发酵后期主要优势属为葡萄球菌属(Staphylococcus)㊁沙雷氏菌属(Serratia)和甲基菌属(Methylobac-terium)㊂宣恩火腿表面真菌落多样性相对稳定，共检出3个门和8个属；发酵前㊁中期的优势属为曲霉属(As-pergillus)㊁未分类真菌g_unclassified_k_Fungi (OTU7)和节菌属(Wallemia)，发酵后期的优势属为曲霉属㊁未分类真菌和酵母(g_unclassified_o_Saccharomycetales)㊂物种相关性网络分析结果表明，曲霉属Aspergillus cibarius 和木糖葡萄球菌呈正相关，与其他细菌呈负相关；帚状曲霉(Aspergillus penicillioides)㊁未分类酵母与木糖葡萄球菌呈负相关，与其他细菌呈正相关㊂功能预测结果表明，细菌和真菌均对宣恩火腿中蛋白质㊁脂肪的降解有重要作用㊂该研究揭示了宣恩火腿发酵过程中表面微生物落演替规律，可为人工接种生产火腿提供参考，以便进一步改善火腿品质㊁缩短加工周期和提升安全性㊂ 关键词㊀宣恩火腿；发酵过程；微生物区系；细菌多样性；真菌多样性；下一代测序技术；功能预测
第一作者：硕士，副教授(邱朝坤教授为通讯作者,E-mail:qiuchaokun@sina)
㊀㊀基金项目：湖北省高等学校优秀中青年科技创新团队计划项目(T201635)；湖北省教育厅科研项目(B2019327)；武汉设计工程学院科研项目
(201808)；湖北省大学生科技创新项目(S202014035007;S202014035008)㊂收稿日期:2020-09-03，改回日期:2020-09-23
㊀㊀宣恩火腿是湖北省恩施自治州一带特产，其在乾隆时期曾作为贡品，以宣恩县所产火腿最负盛名，甚至被誉为中国 四大名腿 之一[1-2]㊂宣恩火腿一直沿用传统工艺生产，微生物自然接种，在长达1~2年的加工过程中，形成了独特的质地和风味㊂关于宣恩火腿发酵过程中蛋白质㊁脂肪等理化指标的变化规律已有报道[2-4]，但宣恩火腿发酵过程中微生物落的变化规律有待揭示㊂
研究微生物落的方法主要包括分离培养
法[5]㊁Biolog-ECO 微平板技术[6]㊁变性梯度凝胶电泳法[7]㊁16S rRNA /18S rRNA /ITS 基因克隆文库测序法[8]和高通量测序法等㊂高通量测序技术，又称下一代测序技术，通过测定细菌16S rRNA 序列㊁真菌ITS 序列等，与对应的物种分类数据库进行比对，从而确定微生物种类和丰度[9-11]；其虽然不能获得纯培养菌株，但一次可测得单个样本中数万条菌株序列信息，故能以更高的灵敏度㊁准确度和相对低廉的价格快速鉴定样本中的微生物种类和丰度，包括丰度很低的种类[12-13]㊂
微生物在火腿发酵过程中扮演着重要角，与火腿的风味㊁品质和安全性密切相关，研究火腿发酵过程中微生物落组成具有很强的实际意义㊂本文利用高通量测序技术对不同发酵期宣恩火腿表面的细菌㊁真菌落多样性进行研究，以期为宣恩火腿建立工业化生产工艺作铺垫㊂
1㊀材料与方法
1.1㊀材料及取样
不同发酵期宣恩火腿表面(肉面)微生物样本，于2019年11月湖北省思乐牧业集团有限公司采样㊂宣恩火腿加工工艺流程[4,14]：选腿(猪后腿)ң修胚ң摊凉ң腌制ң洗腿ң整形ң烘腿ң入库发酵ң洗霉ң修割ң验收㊂自 入库发酵 开始计算发酵时间，取样点为发酵前期(发酵40d，霉菌生长完全覆盖火腿表面)㊁发酵中期(发酵90d，霉菌生长最旺盛阶段)㊁发酵后期(发酵570d，霉菌生长消退；发酵
180d 以上为发酵后期，但发酵1~2年能更好地保证火腿中病毒失活，增加安全性和品质[15])㊂采样参照
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㊀GB 4789.1 2016‘食品安全国家标准食品微生物学检验总则“规定，各阶段样本分别随机选取20个面积约5cm ˑ5cm 的取样区(肉面)，用灭菌棉球反复擦拭火腿表面(肉面)微生物，并清洗到100mL 无菌水中，而后转移至无菌离心管,6000r /min 离心
15min，取沉淀备用㊂
1.2㊀主要仪器与试剂
GeneAmp ®9700型PCR 仪，美国ABI 公司;
QuantiFluor TM -ST 蓝荧光定量系统，美国Promega 公司;Illumina MiSeq 测序平台㊁TruSeqTM DNA Sample Prep Kit，美国Illumina 公司;FastDNA ®SPIN Kit for Soil 土壤DNA 快速提取试剂盒，美国MPbio 公司;TransStart Fastpfu DNA 聚合酶，北京TransGen 生物;AxyPrepDNA 凝胶回收试剂盒，美国Axygen 公司㊂1.3㊀实验方法
1.3.1㊀微生物基因组DNA 的提取及高通量测序
取沉淀样本，用土壤DNA 快速提取试剂盒提取总
DNA,1%琼脂糖凝胶电泳检测后，用NanoDrop 2000测定DNA 纯度和含量㊂通过PCR 扩增细菌16S rRNA V3~V4区，引物为338F(5ᶄ-ACTCCTACGGGAGGCAG-CAG-3ᶄ)㊁806R (5ᶄ-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3ᶄ)，扩增真菌ITS1-ITS2序列，引物为ITS1F(5ᶄ-CTTGGT-CATTTAGAGGAAGTAA-3ᶄ)㊁ITS2R (5ᶄ-GCTGCGTTC-TTCATCGATGC-3ᶄ);PCR 产物经电泳㊁回收㊁定量分析后进行Illumina MiSeq 测序[16]，测序公司为上海美吉生物医药科技有限公司㊂
1.3.2㊀高通量测序结果分析MiSeq 高通量测序结果借助美吉生物云平台进
行分析，主要分析流程为：将测序原始序列进行拼接和质控，按样本进行操作分类单元(operational taxo-
nomic unit,OTU)聚类分析和物种分类学分析，对数据进行抽平处理；基于抽平后的OTU 进行Alpha 多样性分析；基于分类学信息，在不同分类学水平上进行落结构统计分析；并对细菌㊁真菌优势种进行物种相关性网络分析㊁系统发育分析(即进化分析)；并对落功能进行预测㊂
OTU 分析使用Usearch 平台(version 7.0,ht-
tp://drive5 /uparse /)，相似性在97%以上的序列聚为一类，细菌比对Silva 数据库(Release132,ht-tp://www.arb-silva.de)，真菌比对Unite 数据库(Re-lease 7.2, /index.php)；物种相关性网络分析使用Networkx 软件；系统发育分析使用FastTree 软件(version 2.1.3, /fasttree /)；功能预测分析使用PICRUSt 软件包(version 1. 1.0,picrust.github.io /picrust /)，细菌使用EggNOG(evolutionary genealogy of genes:Non-supervised Orthologous Groups,bl.de /)数据库，真菌使用MetaCyc ( /)数据库；样本与物种关系Circos 图用Circos-0.67-7(circos.ca /)完成，其他图使用Excel 软件㊁R 语言工具统计和作图㊂
1.3.3㊀高丰度未知物种的进一步注释
高通量测序结果分析中，一些物种的分类无法确
定(no_rank /unclassified)，挑选其中高丰度OTU 代表序列，在线比对NCBI 中的16S rRNA 或ITS 数据库(如果没有高度相似序列，则进一步比对nr 数据库)，并基于查询的16S rRNA 或ITS 序列，用MEGA7软件通过最大似然法构建系统发生进化树，以对物种进行更精确的注释(Bootstrap 值设置为1000次重复)[17]㊂
2㊀结果与分析
2.1㊀样本序列统计
宣恩火腿样本测序信息见表1㊂经质控㊁拼接，细菌(含古菌)16S rRNA 序列V3~V4区共测得
134721条序列，平均长度426bp；真菌ITS1-ITS2序列共测得111395条序列，平均长度231bp㊂按最小序列数抽平处理[18]，获得抽平后的序列数为细菌38829条/样本㊁真菌36268条/样本㊂
表1㊀样本信息和Alpha 多样性指数
Table 1㊀Sample information and Alpha diversity index
测序区不同发酵期火腿
序列数(抽平后)
sobs 指数shannon 指数simpson 指数ace 指数
chao 1指数coverage 指数细菌/古菌(16S)A(前期)38829190.01620.996757.781530.250.9997B(中期)38829640.10570.976280.784876.750.9995C(后期)38829123 1.61830.2851127.6370125.25
0.9997真菌(ITS)
A(前期)
3626816 1.47000.263319.7768170.9999B(中期)3626819 1.18650.383019191C(后期)36268
16
1.5883
0.2460
1616
1
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2.2㊀宣恩火腿微生物落Alpha 多样性分析
宣恩火腿表面微生物落Alpha 多样性指数见表1㊂多样性指数中,sobs 指数㊁ace 指数和chao1指数可显示落物种的丰富度，数值越大代表物种丰富度越高;shannon 指数和simpson 指数综合反映落多样性,shannon 指数越大代表落多样性越高,simpson 指数越小代表落多样性越高;coverage 指数显示物种覆盖度，值越接近1(即100%)表明测序越全面，越能代表样本真实物种组成情况[19-20]㊂
表1中，所有样本真菌和细菌测序的覆盖率
(coverage)指数均大于99.9%，同时样品稀释曲线趋于平缓(图1)，说明增加测序量只能发现极少量的物种，即测序结果能很好地反应样本微生物多样性㊂宣恩火腿发酵过程中，细菌(含古菌)的sobs㊁ace 和chao1指数持续增加，显示物种丰富度不断提高;
shannon 指数持续显著增加,simpson 指数持续显著减小，显示细菌多样性持续提高㊂发酵过程中，真
菌sobs㊁ace 和chao1指数变化较小，显示真菌物种丰富度变化相对较小；真菌的shannon 指数先减小后增大,simpson 指数先增大后减小，但变化幅度均较小，显示真菌多样性波动较小，呈现微弱的先减小后增大的趋势㊂另外，比较sobs 指数㊁ace 指数和chao 1指数可发现：细菌物种丰富度整体大于真菌㊂
因此，在发酵过程中，宣恩火腿表面细菌丰富度和多样性持续增加，真菌的丰富度和多样性波动较小，且整个发酵过程中细菌物种丰富度大于真菌㊂
图1㊀样品稀释曲线
Fig.1㊀Rarefaction curves of samples
注:A-b㊁B-b㊁C-b 依次为发酵前期㊁中期㊁后期火腿样本的细菌落;A-f㊁B-f㊁C-f 分别为发酵前期㊁中期㊁后期火腿样本的真菌落
2.3㊀宣恩火腿微生物落组成分析
2.3.1㊀细菌(含古菌)落组成分析
在97%的相似水平上对宣恩火腿表面细菌16S
rRNA V3~V4区测序结果进行OTU 分析，通过Venn 图展示宣恩火腿发酵过程中共有和独有的细菌(含
古菌)物种数如图2-a 所示㊂所有样本中共测得133个细菌OTUs，其中发酵前期㊁中期㊁后期的火腿样本依次测得19㊁64㊁123个OTUs；说明宣恩火腿发酵过程中，细菌落丰富度逐渐增加，不断有新的细菌种类参与发酵过程㊂
在门水平上，所有样本共检出11个门的细菌，除
1个丰度很低的古细菌门(Euryarchaeota，广古菌门，占比<0.01%)外，其余10个为真细菌门，主要包括厚壁菌门(Firmicutes)㊁变形菌门(Proteobacteria)㊁拟杆菌门(Bacteroidetes)㊁放线菌门(Actinobacteria)等㊂发酵前㊁中期，厚壁菌门占绝对优势(>99%)；发酵后期，变形菌门占69%，而厚壁菌门下降到27%(图2-b)㊂宣恩火腿表面细菌在属水平(共96个)㊁种水平(共125个)上的组成分别见图2-c 和图2-d㊂图2-d 为Circos 图，是一种描述样本与物种之间对应关系的可视化圈图，其不仅反映了每个样本的优势物种组成比例，同时也反映了各优势物种在不同样本(分组)中的分布比例[21]㊂发酵前㊁中期，葡萄球菌属的木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus )占据绝对优势(>98%)；发酵后期，沙雷氏菌属(Serratia )未知种unclassified_g_Serratia (OTU61)占比最大，为42.2%，前期占优势的木糖葡萄球菌下降到24.9%，根瘤菌科未知属未知种s_uncultured_Rhizobiales_bacterium (OTU113)占20.8%，甲基菌属的藤黄亚甲基杆菌(Methylobacterium fujisawaense )占3.9%,Solitalea 属未培养菌s_uncultured_bacterium_g_Solitalea 占1.9%(OTU72)，芽孢杆菌科未知种s_unclassified_f_Bacil-laceae 占1.6%(OTU37)，其他占4.7%㊂
综上，宣恩火腿发酵中，细菌落丰富度不断增加，各物种相对丰度呈动态变化，发酵前㊁中期主要为木糖葡萄球菌，发酵后期的主要优势属为葡萄球菌属㊁沙雷氏菌属和甲基菌属㊂
2.3.2㊀真菌落组成分析
在97%的相似水平上对真菌ITS1-ITS2测序结
果进行OTU 分析，通过Venn 图展示宣恩火腿发酵过程中共有和独有的真菌物种数目信息(图2-f)㊂3个发酵期样本中真菌落共测得21个OTUs，其中发酵前㊁中㊁后期的火腿样本依次测得16㊁19㊁16个OTUs㊂所有发酵期共有OTUs 为12个，占57%；发酵前期没有独有OTUs，发酵中㊁后期分别独有1㊁2个OTUs㊂因此，宣恩火腿发酵过程中真菌种类较为稳定,57%的种类在整个发酵期始终存在㊂
宣恩火腿真菌包括子囊菌门(Ascomycota)㊁担子
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firmicutes㊀a-细菌OTU 水平Venn 图;b-细菌门水平相对丰度;c-细菌属水平相对丰度;d-细菌种水平circos 图;e-真菌种水平Circos 图;f-真菌OTU 水平Venn 图;g-真菌门水平相对丰度;h-真菌属水平相对丰度
图2㊀宣恩火腿的微生物区系
Fig.2㊀The microbiota of Xuanen ham
注:A㊁B㊁C 依次为发酵前㊁中㊁后期的火腿样本
菌门(Basidiomycota)和未分类的门(unclassified_k_Fungi)㊂发酵过程中，子囊菌门占比持续增加，担子菌门占比不断减少，未分类门呈先增加后减少的趋势(图2-g)㊂宣恩火腿表面真菌在属水平(共8个)㊁种水平(共12个)上的组成分别见图2-h 和图2-e㊂曲霉属(Aspergillus )在发酵过程中较为稳定，发酵前㊁中㊁后期占比依次为37.9%㊁43.2%和41.0%，但在种水平上有物种更替，发酵前㊁中期Aspergillus cibari-us 占优势，而发酵后期帚状曲霉(Aspergillus penicil-
lioides )占优势；未分类真菌s _unclassified _k _Fungi
(OTU7)在发酵前㊁中㊁后期占比依次为24.3%㊁
46.5%和25.6%；节菌属(Wallemia )在发酵过程中逐渐下降，发酵前㊁中㊁后期占比依次为37.6%㊁9.9%和1.5%；未分类酵母unclassified _o _Saccharomycetales (OTU20)由发酵前期未检出㊁中期占0.01%，到发酵后
期占31.1%，说明酵母是发酵后期优势类之一㊂综上，宣恩火腿发酵过程中，真菌种类相对稳定，但各物种相对丰度存在动态变化，发酵前㊁中期主要
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㊀2021Vol.47No.7(Total 427)
是Aspergillus cibarius ㊁未分类真菌(OTU7)㊁节菌属占优势，发酵后期主要优势种为帚状曲霉㊁未分类真菌(OTU7)㊁未分类酵母(OTU20)等㊂
2.4㊀物种相关性网络分析2.4.1㊀单因素网络分析
对宣恩火腿表面细菌㊁真菌优势种分别进行单因
素网络分析，当物种之间的相关系数符合某一阈值(P <0.05)时就用线连接，用不同颜表示物种之间正㊁负相关性[22]，结果见图3-a 和图3-b㊂细菌落中，木糖葡萄球菌与其他种类呈负相关，其他种之间
互为正相关(图3-a)㊂真菌落中，曲霉属Aspergil-lus cibarius 和节菌属s_unclassified_g_Wallemia 呈正相关；这两者与发酵后期占优势的帚状曲霉(A.pen-icillioides )㊁巴恩曲霉菌(A.baarnensis )㊁三角山氏酵母(Yamadazyma triangularis )和未分类酵母s _un-
classified_o_Saccharomycetales(OTU20)均为负相关；后4种真菌互为正相关(图3-b)㊂虽然发酵过程中,
未分类真菌(OTU7)丰度一直很高，但它与其他种类真菌的丰度没有显著相关性，故未在图3-b 中显示㊂
a-细菌种水平单因素网络分析;b-真菌种水平单因素网络分析;c-细菌与真菌种水平双因素网络分析
图3㊀宣恩火腿微生物相关性网络分析
Fig.3㊀Network analysis for microbiota of Xuanen ham
注：节点大小与种的丰度成正比，红连线代表正相关，绿连线代表负相关;a 与b 中节点颜代表门类别,c 中节点颜代表纲类别
2.4.2㊀双因素网络分析
将主要细菌优势种和真菌优势种(作为其他因
子)进行双因素网络分析，结果见图3-c㊂曲霉属As-pergillus cibarius 与木糖葡萄球菌呈正相关，与其他细菌呈负相关；帚状曲霉(A.penicillioides )㊁未分类酵母(OTU20)与木糖葡萄球菌呈负相关，与其他细菌呈正
相关(图3-c)；其他主要真菌与细菌种类没有显著相关性，故未在图3-c 中显示㊂
2.5㊀进化分析
在种水平上对宣恩火腿主要细菌和真菌分别进行进化分析，结果见图4㊂主要细菌种类来自厚壁菌门㊁变形菌门㊁拟杆菌门和放线菌门等4个门(图4-a)；主要真菌种类来自子囊菌门㊁担子菌门和未分类的门(图4-c)㊂将OTU 分析中没有成功注释到种的OTU 代表序列，与NCBI 数据库中相似度最高的序列一起构建个性化系统发生树(图4-b㊁4-d)，以对物种进行更精确的注释㊂
细菌(图4-b)中，根瘤菌科未知种uncultured _
Rhizobiales _bacterium (OTU113)与Methylobacterium
brachiatum 和M.phyllostachyos 聚为一类,16S rRNA 序列一致度为100%，所以OTU113能进一步鉴定到甲基菌属(Methylobacterium )，可能为两者之一；同理，芽孢杆菌科未知属未知种unclassified _Bacillaceae (OTU37)可鉴定为Corynebacterium tuberculostearicum ,
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