王庭柱，高学军，杨振宇
东北农业大学教育部乳品科学重点实验室（150030）
E-mail：wangtingzhu1980@163
摘要：近年来，随着分子生物学和生物信息学的迅速发展，特别是作为生物技术里程碑的PCR技术以及核酸测序和电泳技术的不断改进与完善，产生了许多新的分类学方法，如RAPD、PCR-RFLP、T-RFLP、ARDRA、PCR-SSCP、PCR-DGGE、PCR-TGGE、AFLP、REP-PCR、S-PCR、LCR、LH-PCR、SBCS以及小卫星序列多态性和序列同源性分析等。本文即论述了这些技术在乳酸菌分类鉴定中的应用及其优势和局限性。 关键词：乳酸菌，PCR，分类，鉴定，分子生物学
1. 引言
乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）是一大类缺乏细胞素、糖代谢主要以乳酸为终产物的革兰氏阳性非芽孢细菌，其过氧化氢酶反应为阴性、耐氧耐酸、营养要求复杂并且严格发酵。LAB这个名称就细菌
分类学而言实属一个非正式、非规范的名称。目前从自然界中已发现的这类细菌在分类学上至少可划分为23个属，涉及到的有关菌种则更多，其代表性的菌属有乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、双歧杆菌属、肠球菌属、明串珠菌属、气球菌属、肉杆菌属、酒球菌属、足球菌属、四体球菌属和漫游球菌属等[1,2]。
传统的LAB鉴定方法主要依赖于表型分析，包括形态学观察、生长需要及特性、发酵图谱、细胞壁蛋白分析、血清学以及脂肪酸甲基酯分析等，其中有些技术已被证明适用于某些LAB的鉴定，但是也普遍意识到表型分析的一些缺点，如重现率及辨识能力低、相似的表型特性并不等同于相似的或者关系密切的基因型[3]。表型试验可能的固有问题是，不是每一给定种内的所有菌株都有一个共同的性状，而且即使是同一菌株也可能呈现出一定的生化变异性。此外，实验操作的一点改变也可能产生错误的结果。因此基于表型试验的常规技术并不能对菌株做出明确的鉴定[4]。一般来讲，准确地鉴定一株乳酸菌至菌种的水平，至少需要17种表型实验[5]，但是微生态系统的分离株需要更为简单快速的鉴定方法。因此，需要进行表型特性的分子水平研究和遗传特性的研究。 只有分子生物学技术才能解决LAB鉴定的复杂性。近年来发展起来的核酸技术如DNA 杂交和特定靶序列的扩增技术，对LAB的鉴定是一种改进和补充。在LAB分类学方面，代表性的遗传学方法是限制酶分析（restriction enzyme analysis, REA）的多态性（如PFGE、RFLP 和核糖分型）和PCR技术[3]。REA是进行基因组DNA的限制性内切酶消化。脉冲场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis, PFG
E）是经酶切后，分离出大量的基因组片段；限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP）指的是酶切后含同源序列的酶切片段在长度大小或数目上的差异；而核糖分型（Ribotyping）是以rDNA和/或其间隔区域作为探针，与基因组限制片段进行杂交。PFGE是菌株分类中最有识别力的方法，但是基因组DNA的所有限制片段的完全分离是个困难；迄今，最佳辨识力的遗传探针是种特异性的[6]；而PCR技术以及以PCR为基础的遗传指纹技术和落分析技术甚至可以进行高度菌株特异性的LAB鉴定。
PCR技术的创立打开了LAB快速鉴定的大门，其不仅操作简便、快速可靠并且灵敏高效，而且还克服了对培养的依赖性（自然界中有85～99.9%的微生物至今还不能进行纯培
养）。PCR技术用于LAB的鉴定和鉴别，一些是依赖于扩增子的多少有无，如特异性PCR、多重PCR、PCR-RFLP、ARDRA、T-RFLP、RAPD、AFLP、REP-PCR、LCR、LH-PCR以及小卫星序列多态性等，而另一些则是依赖于等长同源扩增子的序列比较分析或者是其在特殊电泳介质中迁移距离的差异，如序列同源性分析法、PCR-SSCP、PCR-DGGE和PCR-TGGE。以PCR为基础的方法学为LAB鉴定以及混合菌的多样性研究提供了简单快速的方法。本文即对各种PCR技术在LAB分类鉴定研究应用中的原理及其应用的优势和局限性做一综述。
2. 特异性PCR
特异性PCR（Specific PCR），是依据某一（某些）乳酸菌株的已知（同源）基因序列设计菌株（菌种/菌属/菌）特异性的PCR引物，扩增后产生排他性的唯一条带，据此做出鉴定。PCR的特异性取决于引物与模板核苷酸序列的特异性结合，即模板核苷酸顺序的特异性，因此靶序列的选择起着决定性的作用。 目前，多是以蛋白/酶编码基因作为靶序列进行鉴定引物的设计，如聚糖酶（dex）、氨基肽酶C（pepC）、氨基肽酶N（pepN）、胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶（htrA）、重组酶（recA）、N-乙酰溶菌酶（acmA）、脯氨酸亚氨基肽酶（pepI）、addAB、β-半乳糖苷酶（lacz）和谷氨酸脱羧酶（gad）、谷氨酸脱氢酶（gdh）等，且多为菌种（含亚种）水平的，涉及到的菌种有远缘链球菌、变形链球菌[7]、汉毛链球菌[8]、猪链球菌 [9]、嗜热链球菌[10]、瑞士乳杆菌[11]、植物乳杆菌、戊糖乳杆菌、类植物乳杆菌[12]、德氏乳杆菌[13]、乳酸乳球菌[14,15]以及亚种有德氏乳杆菌保加利亚亚种和乳酸亚种[16]、乳酸乳球菌乳酸亚种和乳脂亚种[14,15]；也有依据组氨酸生物合成操纵子序列设计了乳酸乳球菌亚种特异性的PCR引物，可将其乳酸亚种和乳脂亚种鉴别开[17]。此外也有、属特异性PCR引物，如JC Le等比较各种LAB的组氨酸脱羧酶基因（hdcA）设计了特异性引物，可鉴定出所有可使组氨酸脱羧的LAB[18]；FJ Picard 等基于链球菌延伸因子编码基因（tuf）设计了属特异性的PCR引物[19]；甚至也有婴儿双岐杆菌Y1和短双歧杆菌Y8的菌株特异性PCR引物[20]。
随着16s rRNA基因及其结构的发现，认为其可作为遗传标记的“细菌化石”，所以其在分类学上的应用
也越来越广泛，且多是依据16S rDNA可变区设计特异性引物，与其保守区域引物协同使用，进行菌种水平的鉴定，包括鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、副酪乳杆菌[21]、短乳杆菌[22]、植物乳杆菌、发酵乳杆菌、罗伊乳杆菌、唾液乳杆菌[23]、婴儿双岐杆菌、动物双歧杆菌、长双歧杆菌[24]、青春双歧杆菌、齿双歧杆菌[25]、无乳链球菌[26]和乳酸乳球菌[27]；也有上下游引物都是依据保守区域设计，这样可进行更为广阔范围的LAB鉴定，如S Goto 等设计明串珠菌属特异性的PCR引物[28]，而S Nakano等甚至依据16s rDNA设计特异性引物检测乳杆菌属和足球菌属的耐醋酸性LAB[29]。
特异性PCR用于LAB的种属鉴定是很方便直观的，但是用于种属之内的菌株鉴定却很麻烦，因为随着进化距离的降低，同源基因（包括rDNA）的多样性也不是很有效的，关系接近菌株的遗传关系也不容易做出准确的界定。研究表明，16S～23S rRNA基因间序列（intergenic sequences, ITS）能够克服这个问题 [6,30,31]，因为ITS区域的进化压力较小，所以可以提供更大的遗传变异。但是需要针对每一菌株都进行特异性引物设计，这无疑降低了实验的可操作性。
3. 多重PCR
多重PCR（Multiple PCR），是指在1次PCR反应中使用多套/个引物，针对多个乳酸菌DNA模板或同一LAB模板的不同区域进行扩增的过程，依据扩增片段的有无和长短差异做出鉴定。针对于多个DNA模板的多重PCR可同时检测出几个乳酸菌属[32]/菌种[8,12,33～36]甚至是几个菌株[26]，这取决于特
异性PCR引物靶基因的序列特异性；而针对于同一LAB模板的不同区域进行扩增，可以增加鉴定的特异性和检测的准确性，且多为菌种水平[9,31,37,38]，也可达到菌株水平[39]。另外也可通过PCR的嵌套来扩大检测的范围[40]。
Multiple PCR在一个反应管中能够同时检测多种目的DNA，可同时满足分析不同DNA 序列的需要，这不仅能节省珍贵的实验样品，而且能使以往繁琐的操作变得省时省力。一般来说，扩增的靶序列越多，准确性和可靠性越大。多重PCR的主要局限性与PCR反应条件的优化（即退火温度、退火时间以及引物浓度的相对比例）有关，这使得必须选择有相似反应条件的引物，尤其是退火温度。如果有适当可用的序列信息，那么建立和确定潜在的多重PCR方案是可行的。
4. 落分析技术
落分析技术应用于LAB的鉴定方面是基于高分辨率的电泳系统，如单链构象多态性（single-strand conformation polymorphism, SSCP）、变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE）和温度梯度凝胶电泳（temperature gradient gel electrophoresis, TGGE），甚至可检测出1个碱基的序列差异。其基本原理是依据单一rRNA基因的构象差异以及双链rRNA基因的化学稳定性和解链温度的差异对其进行分离, SSCP是基于单链构象的多态性进行中性聚丙酰胺凝胶分离；DGGE的聚丙酰胺凝胶是由一个线性的变性梯度组成的，这个线性的变性梯度是由尿素和甲酰胺形成；而TGG
E 中是一个线性的温度梯度。落分析技术进行LAB的鉴定，多是进行等长16S rRNA特异性PCR扩增子的总体描绘，不仅能够进行多样性的快速判断，同时也可进行多样品的分析[41～44]。
SSCP只适合长度小于200bp的序列检测，而DGGE/TGGE能够进行500bp以下的序列测定，它们的另一个限度是，异种序列也可能有相似的迁移，因此凝胶中相同位置的条带并不能必然地说明它们在系统发生学上是密切相关的。通过缩小梯度可增强分辨率，但是图谱的随后鉴定工作（如杂交分析或者切离条带的克隆测序）也增加了鉴定的复杂性，尽管可以通过选用低拷贝的同源基因作为靶序列以减少所检测的序列数目来降低鉴定的复杂性[45]；也可通过PCR的嵌套来降低对扩增子进行克隆测序的必要性[46]。此外，这些突变检测系统的价格昂贵（约13000美元），也使其广泛应用受到了限制。
5. 遗传指纹技术
改进的遗传指纹技术依赖于特异性PCR扩增子的REA的多态性，PCR-RFLP是先用特定引物特异性扩增基因组DNA，然后用适当的限制性内切酶切割扩增产物，电泳检测多态性[15,47]，而扩增rDNA限制性分析（amplified ribosomal DNA restriction analysis, ARDRA）是基于16s rDNA的RFLP[48～50]。末端限制性片段长度多态性（terminal restriction fragment length polymorphism, T-RFLP）是指应用荧光标记的引物进行PCR，可以产生荧光标记的特异性序列扩增子，随后的限制性酶切以及在高分辨率凝胶中的可视化荧光标记的末端片段，就形成了T-RFLP图谱[51,52]。T-RFLP的主要优势就是改良
的分辨率，这是由核酸测序和数字输出提供的，所以比电泳系统的分辨率更高。T-RFLP能够确定基因型的精细差异，也表现了良好
的灵敏度和高效性。迄今，大多数T-RFLP 主要集中于16S rRNA序列。然而，其他的遗传标记（如hsp基因、谷氨酰胺合成酶、ATPases和拓扑异构酶标记）在评估生物多样性方面也是有用的。总的来说，较之那些利用全基因组的方法（如PFGE、RAPD和AFLP），rRNA 基因的保守性限制了这些技术的辨识力[53]。
6. 序列同源性分析法
最可靠的鉴定就是进行核苷酸测序，同源性分析就是依据某一同源基因序列的保守区域设计通用引物，对LAB基因组DNA进行PCR扩增，随后进行扩增子的测序，而后利用一些必要的计算机软件（如Clustsal W、Tree View、Sequence、Philips和Treecon等）将其与数据库（如Genbank、EMBL、DDBJ、RDP和ARB等）中的同源基因序列进行同源性比较，进而绘制系统进化树，从而做出鉴定。
当前主要是以16S rDNA作为生物系统发育的分子标记，16S rDNA的核苷酸序列为系统发育的分析和鉴定提供了精确的基础 [54,55]，其V1～V3可变区含有种属特异性序列，适合于进行同源性分析，但只有进行全16S rDNA测序得出的结果才是最准确的，这就意味着大约需要测序1500个碱基。目前定义菌种最可靠的方法是DNA-DNA杂交技术，并认为其与16S rRNA序列同一性一致，普遍认为拥有70
%或更高DNA相似性的菌种通常有超过97%的16S rRNA序列同一性。但是16S rRNA序列同一性却不能充分的保证两个分类单元同属一个种，这说明16S rDNA序列分析尚不能够取代DNA-DNA杂交来描绘菌种和计量种内关系。研究表明，乳酸菌16S～23S基因间DNA序列是超变量，如缺乏tDNA（小间隔序列）时其长度约为200bp，也具有充分的种属特异性，可设计PCR引物用于LAB的鉴定，比较乳酸菌16S～23S 基因间序列的相似性，是一种实用的菌株鉴定方法，这些相对较短的序列不仅容易测序也容易比较[5,56,57]。此外，也有用蛋白/酶编码基因序列作为生物系统发育标记，如recA序列[12,22]、ldh序列[24]、sodAint序列[4]和tuf序列[19]。
7. 随机扩增多态性DNA
随机扩增多态性DNA（randomly amplified polymorphic DNA, RAPD），是利用短的随机引物（通常为10-mer）低要求的随机扩增LAB基因组DNA，进行扩增片段的分离后即可给出一个清晰可辨识的指纹，即一个RAPD基因型。RAPD是一个简单快速廉价的方法，但是其重现性低，主要是因为反应条件的小小变化就可引起图谱的改变，因此RAPD必须在可控制的条件下进行，只有进行小心仔细的优化才能够确保结果的可重复性。已证实RAPD分型用于大多数LAB种内和种间特异性鉴定的可靠性[6,21,58,59]。事实上，RAPD是用于分析食品相关LAB中最广泛的技术，其辨识力仅仅低于PFGE分析，更适用于菌株水平LAB的快速鉴定。RAPD的优点是：DNA需要量少、对DNA质量要求不高；操作简易、分析快速；一套引物可用于不同生物的整个基因组的分析、检测的多态性高。其不足之处是
提供的信息量不完整、重复性较差[27,60～62]。
此外，多重RAPD（RAPD和多个随机引物）已成功用于LAB分离株的鉴定[63,64]，这更增强了RAPD技术在LAB菌株水平鉴定的应用性，尤其是在RAPD与信息学技术联合应用的情况下[65,66]。另外也有报道应用RAPD筛选LAB的种特异性和菌株特异性探针和PCR引物[67,68]。
8. 其他以PCR为基础的LAB鉴定方法学
8.1 扩增片段长度多态性
扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism, AFLP）分析是以全基因组DNA限制性片段的选择性扩增为基础的，随后对DNA片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。AFLP分析最初用于植物分类学，后来发现AFLP对于细菌来说也是一个非常有用的指纹技术，可用于菌种和菌株水平的鉴定。迄今为止，AFLP主要用于流行病学以及食品源性病原体毒力指标的测定研究（如李斯特杆菌和沙门菌），也有利用这一技术对种族遗传学上关系密切菌种（戊糖乳杆菌、植物乳杆菌和类植物乳杆菌）进行种水平的鉴定[69]。
8.2 重复非基因回文序列PCR
重复非基因回文序列PCR（repetitive extragenic palindrome-PCR, rep-PCR）的基本原理是利用LAB
基因组上短小、高度保守且反复的序列为 PCR扩增的模板，PCR扩增后产生一些 DNA 片段的图谱，据此来断定细菌间的亲缘关系，可用于LAB亲缘关系的分类，当前主要用于菌种水平的鉴定，如乳酸乳球菌、海格乳杆菌和短乳杆菌，且已经证实不能够用于乳酸乳球菌亚种水平的鉴定[27,67,70]。
8.3 小卫星序列多态性
小卫星序列多态性（Minisatellite polymorphism）分析是以LAB基因组的串联重复序列，即小卫星序列（如6个或更多核苷酸的重复单位）的扩增为基础，据PCR扩增后产生的 DNA 片段图谱来判断LAB间的亲缘关系。P Quenee等鉴定了乳酸乳球菌的7个小卫星序列，并证实了小卫星序列分析是乳球菌株多样性的一个有价值的工具。证明：最大的多态性出现在编码输出蛋白的开放读码框内或者是基因间区域中；2/3的小卫星序列是没用的，尽管在串联重复序列中多达90％是相同的；基于RAPD和小卫星序列分析的树状图表是相似的[62]。
8.4 连接酶链反应
连接酶链反应（Ligase chain reaction，LCR）是一种新的DNA体外扩增和检测技术，是1997年Backman为检出靶基因序列中的点突变而设计发明的。LCR的基本原理为利用DNA连接酶特异地将双链DNA片段连接，经变性-退火-连接三步骤反复循环，从而使靶基因序列大量扩增。LJ Ward等发现乳酸乳球菌乳酸亚种和乳酸乳球菌乳脂亚种16S rRNA基因序列的前200bp内有9～10碱基是有差异的（
依赖于菌株），利用序列180处的单碱基差异建立了1个LCR，进行亚种序列的鉴定[71]。
8.5 长度异质性PCR
长度异质性PCR（length heterogeneity-PCR, LH-PCR）是依据LAB菌株16S rRNA基因序列长度的自然变异来鉴别微生物的，其将PCR扩增与自动测序系统（荧光标记DNA扩增片段的激光检测）结合起来，用于研究微生物菌的DNA指纹技术。C Lazzi1等应用 LH-PCR 研究不太复杂的菌（乳酪天然乳清发酵剂），采用荧光标记的上游引物63F和未标记的下游引物355R扩增16S rRNA基因可变区的Domain A，扩增片段的长度范围是285–346 ± 1 bp，但是LH-PCR不能够鉴别德氏乳杆菌保加利亚亚种和乳酸亚种[72]。
LH-PCR有许多优点：方法可靠、有效、重现性高；理论上不仅可以进行优势菌组成
的定性测定也可进行定量；可快速获得结果，较之那些通过传统凝胶电泳进行片段分离的技术（如DGGE/TGGE）进行过夜电泳，LH-PCR分析仅仅需要30～40 min。但是，LH-PCR和其他PCR基础方法一样，也有PCR所固有的典型偏见，如特定引物对的优先退火、渐增PCR 循环引起嵌合体PCR产物的发生率。此外，仅仅优势菌可能扩增，因此许多的少量成员不能够检测到[73]。
8.6 单个碱基C-序列/测序
单个碱基C-序列/测序（Single Base C-Sequencing, SBCS）是在测序反应中应用dd-CTP's 替代4种双脱氧碱基，并且引物是荧光标记的。V Storms等应用16S rRNA基因前500个碱基的SBCS方法和毛细管电泳联合起来鉴定30株链球菌属的相关菌株，几乎所研究的全部菌种都产生了可辨识的图谱，证实了16S rRNA基因前500个碱基的SBCS对于乳酸菌菌种水平的鉴定来说是很有用的，也是可广泛应用的方法，同时相比于全顺序测定来说，此方法更加快速也更加容易自动化[74]。
此外，近年来，还可见应用于LAB鉴定的位点专一PCR（site-specific PCR, S-PCR）技术，P Basaran等基于乳酸乳球菌乳脂亚种的一个缺失区域设计位点专一引物，建立了一个快速灵敏的乳酸乳球菌乳酸亚种和乳脂亚种鉴定方法[75]。
综上所述，可以看到当前LAB分类学的发展趋势，分子生物学技术，尤其是PCR、核酸测序和电泳技术的不断改进与完善，以及生物信息学的蓬勃发展都为LAB分类和鉴定的研究打开了新视野，打开了LAB快速准确鉴定的大门。只有分子生物学才能解决LAB鉴定的复杂性，但是其也各有局限性，因此对于LAB的分类鉴定，采用多相研究或者组合方法常常是必需的[76,77]。
参考文献
[1] Christensen JE, Dudley EG, Pederson JA. 1999. Peptidases and amino acid catabolism in lactic acid bacteria.
Antonie van Leeuwenhoek, 76: 217-8.
[2] 凌代文, 东秀珠. 1999. 乳酸细菌分类鉴定及实验方法. 中国轻工业出版社. 117-21.
[3] McCartney AL. 2002. Application of molecular biological methods for studying probiotics and the gut flora.
Br J Nutr, 88(Suppl 1): 29-37.
[4] Claire P, Gilles Q, Stephane C. 1998. Identification of Streptococci to Species Level by Sequencing the Gene
Encoding the Manganese-Dependent Superoxide Dismutase. Journal of Clinical Microbiology. 36(1): 41-7. [5] Tannock GW, Tilsala-Timisjarvi A, Rodtong S. 1999. Identification Of Lactobacillus isolates from the
Gastrointestinal Tract, Silage, and Yoghurt By 16s-23s rRNA gene intergenic spacer region sequence comparisons. Applied and Environmental Microbiology, 65(9): 4264-7.
[6] Soile T, Reetta S, Maria S. 1999. Comparison of Ribotyping, Randomly Amplified Polymorphic DNA
Analysis, and Pulsed-Field Gel Electrophoresis in Typing of Lactobacillus rhamnosus and L. casei Strains.
Applied and Environmental Microbiology, 65(9): 3908-14.
[7] Igarashi T, Yamamoto A, Goto N. 2000. PCR for detection and identification of Streptococcus sobrinus. J
Med Microbiol. 49(12): 1069-74.
[8] Igarashi T, Asaga E, Murai C. 2004. Species-specific PCR method for identification of Streptococcus downei.
Lett Appl Microbiol. 38(2): 125-9.
[9] Okwumabua O, O'Connor M, Shull E. 2003. A polymerase chain reaction (PCR) assay specific for
Streptococcus suis based on the gene encoding the glutamate dehydrogenase. FEMS Microbiol Lett. 218(1): 79-84.
进化标记
[10] L ick S, Keller M, Bockelmann . 1996. Rapid identification of Streptococcus thermophilus by primer-specific
PCR amplification based on its lacZ gene. Systematic and Applied Microbiology. 19: 74-7.
[11] F ortina MG, Ricci G, Mora D. 2001. Specific identification of Lactobacillus helveticus by PCR with pepC,
pepN and htrA targeted primers. FEMS Microbiol Lett. 198(1): 85-9.
[12] S andra T, Giovanna EF, Franco D. 2001. Differentiation of Lactobacillus plantarum, L. pentosus, and L.
paraplantarum by recA Gene Sequence Analysis and Multiplex PCR Assay with recA Gene-Derived Primers.
Applied and Environmental Microbiology. 67(8): 3450-4.
[13] L ick S, Brockmann E, Heller KJ. 2000. Identification of lactobacillus delbrueckii and subspecies by
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
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