附录E
（规范性附录）
E.1.1采样点
在清洗后确定检测的每套空调系统的空调部件选择至少5个代表性采样点。 E.1.2采样面积
每一点采样面积应为50cm2。
E.1.3采样方法
空调部件表面积尘较多时用刮拭法采样。积尘较少不适宜刮拭法采样时，用擦拭法采样。整个采样过程应无菌操作。
E.2.1刮拭法
将采集的积尘样品无菌操作称取1g，加入到0.01%Tween-80水溶液中，做10倍梯级稀释，取适宜稀释度1Ml倾注法接种平皿。 E.2.2擦拭法
将擦拭物无菌操作加入到0.01%Tween-80水溶液中，做10倍梯级稀释，取适宜稀释度1ml倾注法接种平皿。
E.3培养与计数
细菌和真菌培养与计数方法见附录C。
附录F
（规范性附录）
空调系统冷却（凝）水中嗜肺军团菌检验方法
F.1原理
F.1.1待测水样经过滤膜或离心浓缩后，一部分样品经酸处理与热处理，以减少杂菌生长，一部分样品不作处理。
F.1.2将上述处理与未处理样品分别接种BCYE琼脂平板并进行培养，生成典型菌落并经生化培养和血清学实验鉴定确认则判定为嗜肺军团菌。
F.2主要仪器设备
主要仪器设备如下：
——90mm的平皿；
——35℃～37℃的二氧化碳培养箱；
——波长为360nm±2nm的紫外灯；
——滤膜滤器；
——孔径为0.22μm～0.45μm的滤膜；
——蠕动泵；
——离心机；
——涡旋振荡器；
——普通光学显微镜；
——荧光显微镜；
——体式镜；
——水浴箱。
F.3采样
F.3.1采样容器：可选择玻璃瓶或聚乙烯瓶，沉积物与软泥需用广口瓶，容器均需螺口或磨口，用前灭菌。
F.3.2采样量：每个采样点依无菌操作取水样（或沉积物、软泥等样品）约200ml。
F.3.3中和：经氯或臭氧等消毒的样品，采样容器灭菌前加入硫代硫酸钠溶液以中和样品中的氧化物。
F.3.4样品运输与贮存：样品应2天内送达实验室，运输时应避光和防止受热，不需冷冻，室温下贮存不应超过15天。
F.4样品处理
F.4.1沉淀或离心：杂质可静置沉淀或1000r/min离心1min去除。
F.4.2过滤：将经沉淀或离心的样品通过孔径0.22μm～0.45μm滤膜过滤，取下滤膜置于15ml灭菌水中，充分洗脱，备用。
F.4.3热处理：取1ml洗脱样品置50℃水浴加热30min。
F.4.4酸处理：取5ml洗脱样品，pH调至2.2，轻轻摇匀，放置5min。
F.4.5接种与培养：取F.4.2洗脱样品、F.4.3热处理样品及F.4.4酸处理样品各0.1ml，分别接种GVPC
平板。将接种平板静置于CO
2培养箱中，温度为35℃～37℃，CO
2
浓度为2.5%。无CO
2
培养箱可采用烛缸培
养法。观察到有培养物生成时，反转平板，孵育10天，注意保湿。
F.5观察结果
军团菌生长缓慢，易被其它菌掩盖，应每天在体式镜上观察。军团菌的菌落通常呈白、灰；菌落整齐，表面光滑，呈典型毛玻璃状，在紫外灯下，部分有荧光。
F.6菌落验证
从每一个平皿上挑取2个可疑菌落，接种BCYE和L－半光氨酸缺失的BCYE琼脂平板，35℃～37℃培养2天，在BCYE琼脂平板上生长，在L－半光氨酸缺失的BCYE琼脂平板不生长的，为军团菌菌落。
F.7嗜肺军团菌型别的确定
F.7.1应进行生化培养与血清学实验确定嗜肺军团菌。
F.7.2生化培养：氧化酶（－/弱+），硝酸盐还原（－），尿素酶（－），明胶液化（＋），水解马尿酸。
F.7.3血清学实验：用嗜肺军团菌诊断血清进行分型。
附录G
（规范性附录）
冷却水中嗜肺军团菌血清1型（LP1）快速检测方法
G.1范围
本标准规定了集中空调通风系统冷却水中嗜肺军团菌血清1型（LP1）检测方法、检测步骤、方法灵敏度和特异度及注意事项。
本标准适用于集中空调通风系统冷却水中嗜肺军团菌血清1型（LP1）快速检测定性检验，可用于突发公共卫生安全事件及重大活动卫生安全保障现场检测集中空调通风系统冷却水中嗜肺军团菌血清1型（LP1）的初筛。
其他类型水体嗜肺军团菌检测可参照执行。
G.2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T18204.5—2013公共场所卫生检验方法第5部分：集中空调通风系统
G.3检测方法
G.3.1原理
胶体金免疫层析法，以胶体金作为示踪标志物，运用抗原抗体反应原理对冷却水中LP1进行定性分析。采用双抗体夹心法检测LP1抗原，当样品中的LP1含量等于或高于最低检测限时，LP1抗原先和金标抗体（Ab-Au）形成反应复合物Ag-Ab-Au。由于层析作用反应复合物沿着硝酸纤维膜向前移动，当遇到检测区（T）包被的抗LP1抗体时，形成Ab-Ag-Ab-Au复合物，在检测区上最终形成一条红反应线，此时结果为阳性；相反，当样品不含LP1抗原或者抗原浓度低于最低检测限时，则检测区无红反应线出现，此时结果为阴性。质控区（C）包被无关控制抗体，与胶体金标记的相关抗原反应形成红反应线作为质控。
G.3.2材料和试剂
胶体金免疫层析试剂盒
采水瓶（250mL～500mL）
过滤浓缩装置：滤膜孔径范围为0.22μm～0.45μm。过滤浓缩时间≤30min，便于携带，有自备电源。
G.4检测步骤
G.4.1样品采集
G.4.1.1采样点的选择：观察待检测的水系统，确保取样点具有代表性；冷却水采集时，应从冷却塔储水槽或冷却水循环管道预留出水口采集水样，采集水样时应避免交叉污染；
G.4.1.2采样点数量：如果冷水机组制冷量≤500冷吨时，设置1～2个采样点，＞500冷吨时，设置2～3个采样点；
G.4.1.3采样位置：在冷却塔储水槽采样时，采样位置应在距塔壁20cm ，液面下10cm 处；在冷却水循环管道预留出水口采样时，应将管道水放15S 后采集，放水时要注意收集，消毒后排放。
G.4.1.4采样量：采集冷却水250-500ml 。
G.4.1.5个人防护：采集样品时应做好个人防护，佩戴头盔、护目镜、口罩、一次性手套。G.4.2样品制备
G.4.2.1杂质去除：如有杂质可静置沉淀去除。
G.4.2.2过滤浓缩：按照试剂盒操作流程将水样过滤浓缩至0.5ml~1ml 备用。
G.4.3检测
G.4.3.1试剂条：在检测开始时打开试剂条密封袋，防止试剂条失效。
G.4.3.2检测：试剂条置于水平面上，将浓缩液置于试剂条待检位置，在规定的时间和良好光照条件下观察试剂条。涡旋振荡器
G.4.4结果判定
G.4.4.1有效结果
1)试纸上规定的位置出现紫红的控制条带和判定条带则为阳性；
2)只出现控制条带为阴性；
G.4.4.2无效结果
控制条带未出现为检测无效。检测失败，需重新检测。
样品接触端判定条带控制条带
嗜肺军团菌LP1阳性
嗜肺军团菌LP1阴
性
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