一种谷氨酰转肽酶荧光/光声探针及其制备方法和应用

1.本发明涉及荧光探针技术领域，特别涉及一种谷氨酰转肽酶荧光/光声探针及其制备方法和应用。

背景技术：

2.γ-谷氨酰转移酶(ggt)是n端亲核水解酶家族的成员。在功能上，ggt可通过切割谷胱甘肽(gsh)或其他γ-谷氨酰胺键的γ-谷氨酰基，实现γ-谷氨酰基向受体底物如水(水解反应)和其他氨基酸或多肽的转移，从而参与细胞内谷氨酰循环和半胱氨酸水平的代谢，在维持细胞氧化还原平衡方面发挥重要作用。在临床实践中，ggt过表达并被公认为与某些疾病的发生和恶化密切相关的重要临床生物标志物，如急性肝损伤性疾病(可在短时间内导致肝功能损害)和肿瘤(一种众所周知的恶性疾病)。因此，发展无创性ggt监测对疾病诊断具有重要意义。
3.荧光成像具有时间分辨率高、空间分辨率高、无创检测等优点。它已广泛应用于化学和生物医学研究，特别是高信噪比的可激活荧光探针。最近，一些ggt酶激活的荧光探针被报道。然而，这些探针在体内检测研究中仍面临波长短、灵敏度有限等问题，不利于实时的体内生物成像。因此，具有长波长、高灵敏荧光响应的理想探针对相关疾病的早期检测显得尤为迫切。由于生物组织在近红外(nir)区域的吸收和自发荧光减少，迫切需要开发和加强近红外荧光成像探针。另一方面，近年来发展起来的光声成像技术是一种无创、无电离辐射的新型生物医学成像方法，可以实现高分辨率、高对比度的组织成像。因此，近红外荧光和光声双模态成像探针的开发，将实现相关疾病(如急性肝损伤)的早期精准检测，提高检测分析的准确性和可靠性。

技术实现要素：

4.本发明提供了一种谷氨酰转肽酶荧光/光声探针及其制备方法和应用，其目的是为了解决背景技术存在的上述问题。
5.为了达到上述目的，本发明的实施例提供了能灵敏检测谷氨酰转肽酶的发光型荧光探针，简称探针nir-ggt；并进一步提供了探针nir-ggt的制备方法和应用。
6.本发明提供了一种谷氨酰转肽酶荧光/光声探针，其分子式为c
47h47
n4o
8+
，结构如式i：
[0007][0008]
进一步的，所述谷氨酰转肽酶荧光/光声探针能抗钾离子、钙离子、镁离子、锌离子、铜离子、铁离子、半胱氨酸、谷胱甘肽、葡萄糖、甘氨酸、维生素c、过氧化氢、次氯酸、亮氨酸氨基肽酶、硝基还原酶的干扰。
[0009]
基于一个发明总的构思，本发明还提供了上述的谷氨酰转肽酶荧光/光声探针的制备方法，包括如下步骤：
[0010]
将nir-nh
2-2置于圆底烧瓶中，加入三光气，用无水二氯甲烷溶解，滴入dipea，常温下搅拌；在氩气保护下加入化合物1，室温下搅拌；在真空条件下去除溶剂，获得混合物；将混合物和三氟乙酸溶解在无水二氯甲烷中，在室温下搅拌后静置；在真空条件下去除溶剂，用硅胶柱层析纯化，获得谷氨酰转肽酶荧光/光声探针，即nir-ggt；
[0011]
所述nir-ggt的合成路径如下：
[0012][0013]
进一步的，所述nir-nh
2-2、三光气、化合物的质量比为60～62:89～178:122～245。
[0014]
进一步的，所述dipea的用量为100μl，无水二氯甲烷的用量为3ml，三氟乙酸的用量为2～6ml。
[0015]
进一步的，所述硅胶柱层析所用试剂为ch2cl2/etoh＝19:1。
[0016]
进一步的，所述去除溶剂采用旋转蒸发仪减压蒸馏法进行去除二氯甲烷。
[0017]
进一步的，所述加入化合物1之后，用硅胶层析柱纯化。
[0018]
本发明还提供了上述的谷氨酰转肽酶荧光/光声探针或上述的制备方法获得的谷氨酰转肽酶荧光/光声探针在检测谷氨酰转肽酶中的应用，包括检测水环境中的谷氨酰转
7.4)随不同量ggt的加入荧光谱图的变化情况；
[0038]
图4是本发明实施例3中nir-ggt(5μmol/l)在hepes缓冲溶液(浓度10mmol/l，ph 7.4)与ggt(0—150u/l)随时间变化的705nm处荧光强度值变化图；
[0039]
图5是本发明实施例4中nir-ggt(5μmol/l)在hepes缓冲溶液(浓度10mmol/l，ph 7.4)对不同干扰分析物的选择性柱状荧光数据图；
[0040]
图6是本发明实施例5中nir-ggt与hepg2细胞中ggt响应的荧光成像图，图a)是不加入nir-ggt的空白成像，图b)是加入nir-ggt孵育40分钟后的成像，图c)是加入ggt抑制剂don孵育12小时后与nir-ggt孵育40分钟的成像；
[0041]
图7是本发明实施例5中nir-ggt与hepg2细胞中ggt响应后的商业线粒体探针和溶酶体探针共定位荧光成像图；
[0042]
图8是本发明实施例5中nir-ggt(5μmol/l)检测在apap诱导的肝损伤模型中ggt的共聚焦荧光成像图，图a)是不加入nir-ggt的空白成像；图b)是加入nir-ggt孵育40分钟后的成像：图c)是先用apap(200μmol/l)预处理细胞12小时，随后用nir-ggt(5μmol/l，40分钟)孵育后的成像，图d)是先apap(500μmol/l)预处理细胞12小时，随后用nir-ggt(5μmol/l，40分钟)孵育后的成像，图e)是先用apap(1000μmol/l)预处理细胞12小时，随后用nir-ggt(5μmol/l，40分钟)孵育后的成像，图(b)是实验组b～e的相对荧光定量图；
[0043]
图9是本发明实施例5中nir-ggt(5μmol/l)检测在apap诱导及nac修复的肝损伤模型中ggt的共聚焦荧光成像图，图a)是加入nir-ggt孵育40分钟后的成像；图b)是先用apap(150μmol/l)预处理细胞12小时，随后用nir-ggt(5μmol/l)孵育40分钟后的成像，图c)是先用nac(400μmol/l)预处理1小时，然后用apap(150μmol/l)处理12小时，随后用nir-ggt(5μmol/l)孵育40分钟后的成像；图d)是先用nac(800μmol/l)预处理1小时，然后用apap(150μmol/l)处理12小时，随后用nir-ggt(5μmol/l)孵育40分钟后的成像；图e)是先用nac(1200μmol/l)预处理1小时，然后用apap(150μmol/l)处理12小时，随后用nir-ggt(5μmol/l)孵育40分钟后的成像。
具体实施方式
[0044]
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
[0045]
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
[0046]
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
[0047]
本发明针对现有的问题，提供了一种谷氨酰转肽酶荧光/光声探针及其制备方法和应用。
[0048]
根据本发明实施例，本发明提供了一种谷氨酰转肽酶荧光/光声探针，其分子式为c
47h47
n4o
8+
，结构如式i：
[0049][0050]
进一步的，所述谷氨酰转肽酶荧光/光声探针能抗钾离子、钙离子、镁离子、锌离子、铜离子、铁离子、半胱氨酸、谷胱甘肽、葡萄糖、甘氨酸、维生素c、过氧化氢、次氯酸、亮氨酸氨基肽酶、硝基还原酶的干扰。
[0051]
基于一个发明总的构思，本发明还提供了上述的谷氨酰转肽酶荧光/光声探针的制备方法，包括如下步骤：
[0052]
将nir-nh
2-2置于圆底烧瓶中，加入三光气，用无水二氯甲烷溶解，滴入dipea，常温下搅拌；在氩气保护下加入化合物1，室温下搅拌；在真空条件下去除溶剂，获得混合物；将混合物和三氟乙酸溶解在无水二氯甲烷中，在室温下搅拌后静置；在真空条件下去除溶剂，用硅胶柱层析纯化，获得谷氨酰转肽酶荧光/光声探针，即nir-ggt；
[0053]
所述nir-ggt的合成路径如下：
[0054][0055]
进一步的，所述nir-nh
2-2、三光气、化合物的质量比为60～62:89～178:122～245。
[0056]
进一步的，所述dipea的用量为100μl，无水二氯甲烷的用量为3ml，三氟乙酸的用量为2～6ml。
[0057]
进一步的，所述硅胶柱层析所用试剂为ch2cl2/etoh＝19:1。
[0058]
进一步的，所述去除溶剂采用旋转蒸发仪减压蒸馏法进行去除二氯甲烷。
[0059]
进一步的，所述加入化合物1之后，用硅胶层析柱纯化。
[0060]
本发明还提供了上述的谷氨酰转肽酶荧光/光声探针或上述的制备方法获得的谷氨酰转肽酶荧光/光声探针在检测谷氨酰转肽酶中的应用，包括检测水环境中的谷氨酰转
肽酶、生物样品中的谷氨酰转肽酶。
[0061]
进一步的，所述谷氨酰转肽酶荧光/光声探针的荧光光谱在705nm处出现峰值，荧光光谱仪的激发波长为680nm。
[0062]
上述应用，具体的，包括：
[0063]
观察加入谷氨酰转肽酶荧光/光声探针前后待测水环境的荧光光谱的变化，荧光激发波长为680nm；或者，观察加入谷氨酰转肽酶荧光探针前后待测生物环境的荧光成像图的变化。
[0064]
所述生物环境，可以是活细胞或小鼠。
[0065]
所述荧光光谱的变化是指：荧光光谱中，705nm处的荧光峰值的变化；如果705nm处峰值升高，则说明含有ggt。优选地，采用荧光光谱仪观察荧光光谱。
[0066]
所述荧光成像图的变化是指：将探针母液加入到生物样品中，用激光共聚焦显微镜，使用激发波长为640nm的光源激发，收集红通道的荧光；观察到红通道荧光增强，则说明含有ggt。优选地，采用激光共聚焦扫描显微镜。
[0067]
上述应用，具体的，包括以下步骤：
[0068]
(1)将探针nir-ggt溶于乙醇，制成探针母液；
[0069]
(2)将探针母液加入到待测液中；
[0070]
用荧光光谱仪测试待测液的荧光光谱，观察期在705nm处的荧光峰值的变化，如果705nm处峰值变大，则说明含有ggt；其中，荧光光谱仪激发波长为680nm；
[0071]
(3)将探针母液加入到生物样品中，用激光共聚焦显微镜，使用激发波长为640nm的光源激发，收集红通道的荧光；若观察到红通道荧光增强，则说明含有ggt。
[0072]
首先，水溶液中的ggt可以引起荧光探针的荧光光谱变化，即荧光探针与ggt的特异反应引发近红外荧光信号变化，主要是由于荧光探针上特异性识别基团能与分析物ggt结合，具体表现为ggt会水解荧光探针上的谷氨酸单元，切断荧光探针的酰胺键导致荧光探针的分子内电荷转移增强，从而使其荧光恢复，实现快速、高灵敏ggt检测。
[0073]
实施例1
[0074]
nir-ggt的合成：
[0075][0076]
将化合物nir-nh
2-2(61.6mg，0.1mmol)置于圆底烧瓶，随后加入三光气(89.0mg，0.3mmol)，用无水二氯甲烷溶解，滴入dipea(100μl)，常温下搅拌8小时，在氩气保护下加入化合物1(122.4mg，0.3mmol)。将混合物在室温下搅拌8小时。然后在真空条件下除去溶剂，得到混合物。然后将混合物和三氟乙酸(1.5ml)溶解在3ml无水二氯甲烷中。将混合物在室温下搅拌过夜。然后在真空条件下去除溶剂，用硅胶柱层析纯化，得到蓝固体nir-ggt(13.4mg，产率15％)。其氢谱和质谱如图1、2所示，1h nmr(400mhz,cd3od)δ8.87(d,j＝
14.9hz,1h),8.22(d,j＝7.9hz,1h),7.96(d,j＝1.7hz,1h),7.80(t,j＝7.0hz,1h),7.68(m,2h),7.60(d,j＝8.4hz,2h),7.53(s,2h),7.50
–
7.43(m,2h),7.40(d,j＝8.3hz,2h),7.32(d,j＝7.6hz,1h),7.08(dd,j＝8.7,2.0hz,1h),6.67(d,j＝8.7hz,1h),6.52(d,j＝14.9hz,1h),5.20(s,2h),3.85(s,3h),3.71(s,3h),3.66(t,j＝5.6hz,1h),2.71(t,j＝4.8hz,2h),2.63(t,j＝7.1hz,2h),2.23
–
2.14(m,4h),2.03(m 2h),1.86(s,6h).esi(qtof-ms):maldi-tof(ms):c
47h47
n4o
8+
[m]
+
,found 795.5.
[0077]
实施例2
[0078]
nir-ggt与不同当量ggt反应的荧光光谱变化
[0079]
取实施例1制备的nir-ggt溶于etoh中，制成浓度为500μmol/l探针母液。用10mmol/l hepes(ph 7.4)稀释至5μmol/l作为测试溶液，加入不同浓度的ggt母液，配置成探针浓度为5μmol/l的hepes测试溶液。用荧光光谱仪测试探针与不同浓度ggt反应液的荧光光谱变化(激发波长为680nm)，荧光光谱变化情况如图3所示。随着加入ggt浓度的逐渐增加，探针在705nm处的荧光峰值逐渐增强。
[0080]
实施例3
[0081]
nir-ggt与ggt随时间变化的荧光变化
[0082]
从实施例2中荧光探针母液中取出部分用10mmol/l hepes(ph 7.4)稀释至5μmol/l作为测试溶液，加入不同浓度的ggt(0、20、50、100、150u/l)，配制成探针浓度为5μmol/l，ggt浓度为(0、20、50、100、150u/l)的测试溶液。用680nm的激发波长，测试其随时间变化的荧光光谱。荧光光谱随时间变化情况如图4所示，在不同浓度的ggt(0、20、50、100、150u/l)的作用下，nir-ggt的荧光强度在60min内达到平台期。
[0083]
实施例4
[0084]
nir-ggt对不同干扰分析物的选择性研究
[0085]
从实施例2中荧光探针母液中取出部分用10mmol/l hepes(ph 7.4)稀释至5μmol/l作为测试溶液，分别加入不同分析物：钾离子、钙离子、镁离子、锌离子、铜离子、铁离子、半胱氨酸、谷胱甘肽、葡萄糖、甘氨酸、维生素c、过氧化氢、次氯酸、亮氨酸氨基肽酶、硝基还原酶。反应90分钟后检测测试液的荧光光谱变化。如由图5所示，可以发现，相对于空白测试液，各种分析物的测试液荧光强度均没有明显变化。然而，加入ggt的测试液的荧光强度发生了显著增强。实验结果说明nir-ggt对ggt具有良好的选择性。
[0086]
实施例5
[0087]
nir-ggt与细胞中ggt的荧光成像研究
[0088]
从实施例2中荧光探针母液中取出10μl加入到育有hepg2细胞的培养皿(含高糖dmem培养基添加10％胎牛血清和1％抗生素)中，探针浓度为5μmol/l；实验组1为空白的hepg2细胞，实验组2用探针nir-ggt(5μmol/l)孵育40分钟，实验组3先用ggt抑制剂don(1000μmol/l)处理，再用nir-ggt(5μmol/l)孵育40分钟。随后用共聚焦显微镜对实验组进行荧光成像，使用激发波长为640nm的光源激发，收集红通道的荧光，结果如图6所示，图a)在实验组1中可以观察到无红通道荧光，图b)实验组2中可以观察到明显的红通道荧光，图c)实验组3能观察到极为微弱的红荧光。实验结果说明探针nir-ggt可以专一性通过共聚焦显微镜检测细胞环境中的ggt，具有潜在的实际应用价值。
[0089]
从实施例2中荧光探针母液中取出10μl加入到育有hepg2细胞的培养皿(含高糖
dmem培养基添加10％胎牛血清和1％抗生素)中，探针浓度为5μmol/l；实验组1样品使用商用线粒体向荧光探针(红)染细胞线粒体，染完成用探针nir-ggt工作液孵育细胞40分钟。随后分别用共聚焦显微镜对控制组和实验组进行荧光成像，分别使用激发波长为561nm和640nm的光源激发，收集红通道和绿通道的荧光，实验组2样品使用商用溶酶体向荧光探针(绿)染细胞溶酶体，染完成用探针nir-ggt工作液孵育细胞40分钟。随后分别用共聚焦显微镜对控制组和实验组进行荧光成像，分别使用激发波长为488nm和640nm的光源激发，收集红通道和绿通道的荧光，结果如图7所示。可以看到实验组线粒体绿红共定位情况良好。实验结果说明nir-ggt可以很好地靶向到线粒体上，具有潜在的实际应用价值。
[0090]
从实施例2中荧光探针母液中取出10μl加入到育有hepg2细胞的培养皿(含高糖dmem培养基添加10％胎牛血清和1％抗生素)中，探针浓度为5μmol/l，孵育40分钟，作为控制组b；控制组a为空白的hepg2细胞；实验组c样品用apap(200μmol/l)预处理细胞12小时，随后用探针nir-ggt(5μmol/l，40分钟)孵育，实验组d用apap(500μmol/l)预处理细胞12小时，随后用探针nir-ggt(5μmol/l，40分钟)孵育，实验组e用apap(1000μmol/l)预处理细胞12小时，随后用探针nir-ggt(5μmol/l，40分钟)孵育。随后分别用共聚焦显微镜对控制组和实验组进行荧光成像，使用激发波长为640nm的光源激发，收集红通道的荧光，结果如图8所示。图a)，在控制组a的荧光成像中，无红荧光；图b)，在控制组b中，可以观察到微弱的红通道荧光，图c)，实验组c中能观察到明显的红荧光，图d)，实验组d能观察到较明显的红荧光，图e)，实验组e能观察到极明显的红荧光，图(b)是实验组b～e的相对荧光定量图。实验结果说明探针nir-ggt可以通过共聚焦显微镜检测肝损伤细胞环境中的ggt，具有潜在的实际应用价值。
[0091]
从实施例2中荧光探针母液中取出10μl加入到育有hepg2细胞的培养皿(含高糖dmem培养基添加10％胎牛血清和1％抗生素)中，探针浓度为5μmol/l，孵育40分钟，作为控制组a；实验组b样品用apap(150μmol/l)预处理细胞12小时，随后用探针nir-ggt(5μmol/l)孵育40分钟，实验组c用nac(400μmol/l)预处理1小时，然后用apap(150μmol/l)处理12小时，随后用探针nir-ggt(5μmol/l)孵育40分钟；实验组d用nac(800μmol/l)预处理1小时，然后用apap(150μmol/l)处理12小时，随后用探针nir-ggt(5μmol/l)孵育40分钟；实验组e用nac(1200μmol/l)预处理1小时，然后用apap(150μmol/l)处理12小时，随后用探针nir-ggt(5μmol/l)孵育40分钟。随后分别用共聚焦显微镜对控制组和实验组进行荧光成像，使用激发波长为640nm的光源激发，收集红通道的荧光，结果如图9所示。图a)在控制组a的荧光成像中，观察到微弱的红通道荧光；图b)在实验组b中，可以观察到明显的红通道荧光，图c)实验组c中可以观察到微弱的红通道荧光，图d)实验组d能观察到较微弱的红荧光，实验组图e)e能观察到极微弱的红荧光。实验结果说明探针nir-ggt可以通过共聚焦显微镜检测肝损伤细胞修复环境中的ggt，具有潜在的实际应用价值。
[0092]
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：

1.一种谷氨酰转肽酶荧光/光声探针，其特征在于，其分子式为c
47
h
47
n4o
8+
，结构如式i：2.根据权利要求1所述的谷氨酰转肽酶荧光/光声探针，其特征在于，所述谷氨酰转肽酶荧光/光声探针能抗钾离子、钙离子、镁离子、锌离子、铜离子、铁离子、半胱氨酸、谷胱甘肽、葡萄糖、甘氨酸、维生素c、过氧化氢、次氯酸、亮氨酸氨基肽酶、硝基还原酶的干扰。3.如权利要求1或2所述的谷氨酰转肽酶荧光/光声探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将nir-nh
2-2置于圆底烧瓶中，加入三光气，用无水二氯甲烷溶解，滴入dipea，常温下搅拌；在氩气保护下加入化合物1，室温下搅拌；在真空条件下去除溶剂，获得混合物；将混合物和三氟乙酸溶解在无水二氯甲烷中，在室温下搅拌后静置；在真空条件下去除溶剂，用硅胶柱层析纯化，获得谷氨酰转肽酶荧光/光声探针，即nir-ggt；所述nir-ggt的合成路径如下：4.根据权利要求3所述的谷氨酰转肽酶荧光/光声探针的制备方法，其特征在于，所述nir-nh
2-2、三光气、化合物的质量比为60～62:89～178:122～245。5.根据权利要求3所述的谷氨酰转肽酶荧光/光声探针的制备方法，其特征在于，所述dipea的用量为100μl，无水二氯甲烷的用量为3ml，三氟乙酸的用量为2～6ml。6.根据权利要求3所述的谷氨酰转肽酶荧光/光声探针的制备方法，其特征在于，所述硅胶柱层析所用试剂为ch2cl2/etoh＝19:1。7.根据权利要求3所述的谷氨酰转肽酶荧光/光声探针的制备方法，其特征在于，所述去除溶剂采用旋转蒸发仪减压蒸馏法进行去除二氯甲烷。
8.根据权利要求3所述的谷氨酰转肽酶荧光/光声探针的制备方法，其特征在于，所述加入化合物1之后，用硅胶层析柱纯化。9.如权利要求1或2所述的谷氨酰转肽酶荧光/光声探针或如权利要求3～8任一项所述的制备方法获得的谷氨酰转肽酶荧光/光声探针在检测谷氨酰转肽酶中的应用，其特征在于，包括检测水环境中的谷氨酰转肽酶、生物样品中的谷氨酰转肽酶。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述谷氨酰转肽酶荧光/光声探针的荧光光谱在705nm处出现峰值，荧光光谱仪的激发波长为680nm。

技术总结

本发明提供了一种特异性检测细胞体内GGT的荧光探针的制备方法及其用途，本发明荧光探针与GGT响应后，705nm处的荧光强度增强。本发明荧光探针可以通过共聚焦荧光显微镜检测活细胞的GGT，并进行荧光成像。本发明的荧光探针合成简单，不仅能够对水溶液中GGT进行特异性和快速检测，且可实现肝损伤环境中GGT的检测，具有一定的潜在实用价值。具有一定的潜在实用价值。具有一定的潜在实用价值。