的：
1.2掌握分子电泳的基本步骤，掌握计算蛋白质相对分子质量的方法。 二、实验内容和原理：
2. 1电泳（electrophoresis）：是指带电颗粒在电场中向着与它电性相反的电极移动的现象。许多重要的生物分子都含有可电离基团（如氨基酸、多肽、蛋白质、核甘酸、核酸等），在非等电点条件下可解离成带有电荷分子，在电场力的作用下，它们向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳技术就是利用样品中各种分子带电性质、分子大小、形状等的差异，在电场中的迁移速度不同，从而对样品进行分离、纯化和鉴定的一种综合技术。可用于样品的制备、纯度鉴定、分子量测定等。 2. 2影响带电粒子在电场中泳动的因素：①生物分子的性质：待分离生物大分子所带电荷的多少、性质、分子大小和形状都会对电泳产生明显影响。
②缓冲液：缓冲液pH值直接影响生物分子的解离程度和带电性质。溶液pH 值距离等电点愈远，生物分子所带净电荷就越多，电泳时速度就越快。当缓冲液pH大于等电点时，生物分子带负电荷，电泳时向正极移动；当缓冲液pH小于等电点时，生物分子带正电荷，电泳时向负极移动。③电场强度：电场强度指
每单位介质长度的电位梯度（又称电位差或电位降）。一般而言，电场强度越大，电泳速度越快。但随着电场强度的增大会引起通过介质的电流强度增大，从而造成电泳过程产生的热量增多，最终导致介质温度升高。降低电流强度，可以减少产热，但会延长电泳时间, 引起生物分子扩散增加，同样影响分离效果。所以电泳实验中要选择适当的电场强度。④电渗：液体在电场中对于固体支持介质的相对移动称为电渗。由于支持介质表面存在一些带电基团，如滤纸表面含有竣基，琼脂含有硫酸基等。这些基团电离后 使支持介质表面带电，吸附一些带相反电荷的离子在电场作用下向电极方向移动，形成介质表面溶液的流动。当电渗方向与电泳方向相同时则加快电泳速度；当电渗方向与电泳方向相反时，则降低电泳速度。⑤支持介质的筛孔：支持介质的筛孔大小对生物大分子的电泳迁移速度有明显的影响。在筛孔大的介质中泳动速度快，反之则泳动速度慢。
2.3电泳技术的分类：①根据电泳中是否使用支持介质分为自由电泳和区带电泳：自由电泳不使用支持介质，电泳在溶液中进行；区带电泳需使用支持介质，根据支持介质不同可分为醋酸纤维薄膜电泳、薄层电泳和凝胶电泳等。根据支持介质的装置形式不同又可分为水平板式电泳、垂直板式电泳、垂直盘状电泳、毛细管电脉等。②根据电泳时电压的高低分为高压电泳和常压电泳：高压电泳使用的电压在500〜1000V，这类电泳分离速度快，但热效应较大，必须具备冷却装置，主要适用于小分子化合物的快速分离；常压电泳使用的电压在500 V以下，电位梯度为2〜10 V /cm。这类电泳的分离速度较慢，
但对电泳设备要求简单。③根据电泳系统pH是否连续分为连续pH 电泳和不连续pH电泳：连续pH电泳是指电泳全过程中pH保持不变；不连续pH电泳是指电极缓冲液和电泳支持介质中的pH不同，甚至电泳支持介质不同区段的pH也不相同，如聚丙烯酰胺凝胶电泳。④根据工作目的和分离样品的数量多少分为分析电泳和制备电泳。⑤.根据结合配套的技术种类不同分为免疫电泳、层析电泳、等电聚焦电泳、转移电泳、双相电泳、脉冲梯度电场凝胶电泳和相互垂直交替电场凝胶电泳等。⑥根据电泳物质类别不同分为细胞电泳、核酸电泳、蛋白质电泳等。
2. 4电泳示踪剂：电泳常用的示踪剂有澳酚兰和二甲苯青FF。示踪剂一般与蔗糖、甘油组成上样缓冲液，蔗糖、甘油可增加溶液密度，使其比重增加，以确保样品均匀沉入加样孔内。
2. 5聚丙烯酰胺凝胶：是由丙烯酰胺(Acr)与交联剂亚甲基双丙烯酰胺
(Bis)在催化剂作用下，经过聚合交联形成含有亲水性酰胺基侧链的脂肪族长链，相邻的两个链通过亚甲基桥交联起来的三维网状结构的凝胶。具有机械强度好•、弹性大、透明、化学稳定性高、无电渗作用、设备简单、样品量小(1-100 ng)，分辨率高等优点，并可通过控制单体浓度或与交联剂的比例聚合成不同大小孔径的凝胶。可用于蛋白质、核酸等不同大小的生物分子的分离、定性和定量分析；还可结合解离剂十二烷基硫酸钠(SDS)以测定蛋白质亚基的相对分子质量。
2. 6聚丙烯酰胺凝胶的聚合体系有两种：①化学聚合：通常采用过硫酸钱(AP)为催化剂，四甲基乙二胺
(TEMED)为加速剂。在TEMED加速作用下，过硫酸镂可使丙烯酰胺单体的双键打开、活化形成自由基丙烯酰胺, 从而引发聚合作用。②光聚合：通常采用核黄素作催化剂，核黄素在光照下光解成无基，后者再被氧化成自由基而引发聚合作用。光聚合的凝胶孔径较大，而且随时间延长而逐渐变小，不太稳定。化学聚合的凝胶孔径较小，且各次制备的重复性好。故一般采用化学聚合。
2. 7不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳有三种效应：浓缩效应、电荷效应和分子筛效应。①浓缩效应在浓缩胶中进行；分子筛效应在分离胶中进行；电荷效应在浓缩胶和分离胶中都有。②蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时, 它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。
2.8SDS：是一种阴离子型去污剂，在蛋白质溶解液中加入SDS和疏基乙醇后，疏基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原；SDS能使蛋白质的非共价键(氢键、疏水键)打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质SDS 复合物。由于SDS带有大量负电荷，当它与蛋白质结合时，所带的负电荷的量大大超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差异；SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变；蛋白质-SDS复合物在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒。不同蛋白质的SDS复合物
的短轴长度都一样，而长轴则随蛋白质相对分子质量的大小成正比地变化；这样的蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭圆棒的长度，也就是蛋白质相对分子质量的函数。
二、实验器材和材料
1.1实验器材：垂直板型电泳装置，直流稳压电源(电压300~600V, 电流50~100mA) , 50 uL、200 uL、1000 u L的微量注射器，小烧杯。
2.2实验试剂：2% (V/V) TEMED溶液，10% (W/V)过硫酸镂溶液，蛋白质样品溶解液，分离胶缓冲溶液，浓缩胶缓冲溶液，凝胶贮液，10烬DS 溶液，电极缓冲溶液，染液，脱液。
3.3实验对象：标准蛋白质纯品、小鼠肝的蛋白质提取物三、实验方法和步骤
3.1安装垂直板型电泳装置：
3.1.1将玻璃板用蒸储水洗净烘干，是否洗净可通过是否有水珠悬挂于板上判断。
3.1.2把玻璃板在灌胶支架上固定好。固定玻璃板时，两边用力一定要平均，防止夹坏玻璃板，同时也要注意大小两块板要对齐，夹紧，防止溶液漏出。
3.2凝胶的制备：sds聚丙烯酰胺凝胶电泳
3.2.1分离胶的制备：
在小烧杯中配制溶液，先加入4. 0mL凝胶贮液、1.25mL分离胶缓冲溶液、0.液L10%SDS溶液、4.0mLddH20、0.06mL10%过硫酸锭，然后加入0. 6mL2% (V/V) TEMED溶液。将所配凝胶液沿着凝胶的长玻璃片的内面加至长、短玻
璃片的窄缝内，加胶高度距样品槽模板下缘1cm。用滴管沿玻璃片内壁加一层蒸馆水，使胶面平整。等分离胶面不会因倾斜而倾斜时，去掉水封层，并用滤纸条吸干。
3.2. 2浓缩胶的制备：
在另一个干净的小烧杯中，先加入0.75mL凝胶贮液、0. 83mL浓缩胶缓冲溶液、0. lmL10%SDS溶液、3. 0mLddI120> 0. 02mL 10%过硫酸钱，然后加入0.2mL2% (V/V) TEMED溶液。混匀后将凝胶溶液加到已聚合的分离胶上方，直至距短玻璃片上缘0.5cm处，轻轻将“梳子”插入浓缩胶中，使凝胶顶部形成无数个相互隔开的凹槽，然后放置30min。之后小心拔去“梳子”。
4.3加样：
将PH8. 3的电极缓冲液倒入内外贮槽中，内槽中液面应没过短玻璃片, 如果内槽漏水，则外槽液面应与内槽液面相同。在同一块凝胶上两组分别用微量注射器在样品凹槽内依次加入牛血清，E1样品1, E1样品2，蛋白marker, E2样品1, E2样品2，牛血清样本。加样体积为：蛋白质样品液, 牛血清样品液均为15 u L；蛋白质marker为5 u L。
3.4电泳:
将上槽接负极，下槽接正极，打开电源，开始时将电压控制在70V, 待样品进入分离胶后，改为90V。待蓝染料迁移至下端约1cm左右时，停止电泳。
3. 5剥胶：
将电泳槽中的凝胶板取出，将凝胶取出放入一大培养皿中。剥完胶之后同时做染和转膜。
3. 6染和脱：
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