目的要求
（1）学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。 （2）掌握SDS-PAGE测定蛋白质分子量的操作方法。 原理
SDS-PAGE是PAGE是一种特殊形式，SDS是带负电荷的阴离子去污剂。用SDS-PAGE 测定蛋白质分子量时，蛋白质需经样品溶解液处理。在样品溶解液中含有巯基乙醇及SDS，各种蛋白质样品在巯基乙醇作用下，还原成单链，再进一步与SDS结合形成带大量负电荷的SDS-蛋白质复合物。因此各种蛋白质分子在SDS-PAGE中，只能按其分子量大小而分离。
SDS-PAGE有连续体系（b）及不连续体系两种(d)，这两种体系有各自的样品溶解液及缓冲液，但加样方式，电泳过程及固定、染与脱方法完全相同。
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳。这种凝胶是以丙
烯酰胺单体（Acrylamide，简写为Acr）和交联剂N，N'-甲叉双丙烯酰胺（N,N'-Methylena Bisacrylamide，简写为Bis）在催化剂的作用下聚合而成的。
Acr 和Bis 在它们单独存在或混合在一起时是稳定的，且具有神经毒性，操作时应避
免接触皮肤。但在具有自由基团体系时，它们聚合。引发产生自由基团的方法有两种，即化学法和光化学法。化学聚合的引发剂是过硫酸铵(NH4)2S2O3（Ammonium persulfate，简写为Ap），催化剂是N，N，N',N'-四甲基乙二胺（Tetramethylenediamine，简写为TEMED）。在催化剂TEMED的作用下，由过硫酸铵（Ap）形成的自由基又使单体形成自由基，从而引起聚合作用。TEMED 在低pH 时失效，会使聚合作用延迟；冷却也可使聚合速度变慢；一些金属抑制聚合；分子氧阻止链的延长，防碍聚合作用。这些因素在实际操作时都应予以控制。光聚合以光敏感物核黄素（即V B2）作为催化剂，在痕量氧存在下，核黄素经光解形
成无基，无基被氧再氧化成自由基，从而引起聚合作用。过量的氧会阻止链长的增加，应避免过量氧的存在。光聚合形成的凝胶孔径较大，而且随着时间的延长而逐渐变小，不太稳定，所以用它制备大孔径的浓缩胶较为合适。采用化学聚合形成的凝胶孔径较小，而且重复性好，常用来制备分离胶。
聚丙烯酰胺的基本结构，为丙烯酰胺单位构成的长链，链与链之间通过甲叉桥联结在
一起。链的纵横交错，形成三维网状结构，使凝胶具有分子筛性质。网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动，使凝胶具有良好的抗对流作用。此外，长链上富含酰胺基团，使其成为稳定的亲水凝胶。该结构中不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。这些特点，使得聚丙烯酰胺适合作区带电泳的支持介质。
聚丙烯酰胺凝胶的质量主要由凝胶浓度和交联度决定。每100ml 凝胶溶液中含有的单
体（Acr）和交联剂（Bis）总克数称为凝胶浓度，用T％表示。凝胶溶液中，交联剂（Bis）占单体（Acr）和交联剂（Bis）总量的百分数称为交联度，用C％表示。改变凝胶浓度以便适应各种样品的分离。一般常用7.5％浓度的聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质，而用2.4%的
分离核酸。但根据蛋白质与核酸分子量不同，适用的浓度也不同（见表1）
热休克蛋白 Heat Shock Proteins (HSPs)，是在从细菌到哺乳动物中广泛存在一类热应急蛋白质。当有机体暴露于高温的时候，就会由热激发合成此种蛋白，来保护有机体自身。许多热休克蛋白具有分子伴侣活性。按照蛋白的大小，热休克蛋白共分为五类，分别为HSP100，HSP90，HSP70，HSP60 以及小分子热休克蛋白 small Heat Shock Proteins (sHSPs)( Kyeong et al., 1998)。
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳HSPs具有多种功能，包括赋予细胞以耐热性以抵抗高温，作为分子伴侣以防止蛋白聚集，对坑正常的
细胞死亡，从而调节细胞的生存和死亡的平衡。许多小分子热休克蛋白基因一般并不表达，显著表达小分子热休克蛋白一般是细胞受到外部刺激的时候，比如高温刺激。现已发现，除了热刺激之外还有许多物理、化学刺激可以激活小分子热休克蛋白的表达，例如紫外线、射线、机械损伤、酸、氧化剂等等。可见，小分子热休克蛋白是抵御外界不良刺激的重要物质。
试剂与器材
一、试剂
1.分子量测定标准蛋白
目前国内外均有厂商生产低分子量及高分子量标准蛋白成套试剂盒，用于SDS-PAGE 测定未知蛋白质分子量。
（1）高分子量标准蛋白试剂盒（Pharmacia公司产品，表1）。
表1 5种标准蛋白质
蛋白质名称分子量来源
甲状腺球蛋白669000 猪甲状腺
铁蛋白440000 马肺
豫公网安备41160202000603
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