姓名：mangogola
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理是：蛋白质在电泳中的迁移速率取决于其所带电荷、分子大小以及形状等因素，而大多数蛋白质与SDS按一定比例结合（1:1.4/g:g），这样使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，而且形状为短轴相同的雪茄烟形。由此蛋白质分子的电泳迁移率仅取决于其分子量，在特定凝胶浓度下，一定范围内的蛋白质分子量对数与迁移率呈直线关系，选择分子量范围和性质与待测样品相近的蛋白质作标准蛋白，与样品同时电泳计算得到标准曲线，并根据待测样品的相对迁移率在标准曲线上查出其分子量。 一．实验过程
浓缩胶浓度4%，交联度2.7% |
[Acr（30%）：Bis（0.8%）]溶液 | 0.67ml |
dd水 | 3.05ml |
0.5M pH6.8 Tris-Hcl（0.4%SDS）溶液 | 1.25ml |
TEMED（原液） | 6ul |
将以上成分加入小烧杯中轻轻摇匀，加入10%的硫代硫酸铵0.026ml，摇匀后灌胶。 |
| |
分离胶浓度12%，交联度2.7% |
[Acr（30%）：Bis（0.8%）]溶液 | 4ml |
dd水 | 3.44ml |
1.5M pH8.8 Tris-Hcl（0.4%SDS）溶液 | 2.5ml |
TEMED（原液） | 6ul |
将以上成分加入小烧杯中轻轻摇匀，加入10%的硫代硫酸铵0.056ml，摇匀后灌胶。 |
| |
1.凝胶工作液的配制
2.灌制分离胶
将制胶玻璃板清洗安装紧密后，插入制孔器，在距制孔器下端1cm处做一标记，取下制孔器将分离胶溶液加入两块玻璃板之间至标记处。然后立即用注射器向凝胶液面轻轻铺上一层厚约0.5cm的dd水，目的是使凝胶面平整，放置待其聚合凝固。
3.灌制浓缩胶
将分离胶上的双蒸水用注射器取出并用滤纸吸干，放入制孔器，用滴管灌入浓缩胶至玻璃板顶端待其聚合凝固。
4.待测样品的制备
取0.1ml透析除盐后的样品稀释液（浓度在0.2mg/ml左右），加入0.1ml样品溶解液，混匀后沸水浴5min，冷却。（沸水浴的目的是使蛋白质变性成肽链，便于与SDS结合，甘油可以增加蛋白质的比重，便于沉降到加样孔底部，不易飘散）
5.加样和电泳
将电极缓冲液注入缓冲液槽，然后轻轻拔出制孔器，加样后连接电泳仪，记录每个加样孔的样品类型及上样量。浓缩胶使用50V恒压，分离胶使用100V恒压。
6.染和脱
用取胶片将两张玻璃板撬开，取出凝胶，切去浓缩胶部分及染料前端至分离胶底端部分，并在剩余胶片的右上角切去一块作为标记。而后转入盛有染液的大培养皿中，低速振荡
染1.5h，然后分别用高浓度和低浓度甲醇溶液脱1.5h，最后用低浓度甲醇溶液脱过夜至背景脱。
二．数据记录和处理
1.标准曲线绘制
蛋白质Marker的相对迁移率如下表：
类别 | 分子量M | ㏒M | 样品迁移距离（cm） | 染料迁移距离（cm） | 相对迁移率 |
兔磷酸化酶B sds聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 97400 | 4.988559 | 0.95 | 4.3 | 0.220930 |
牛血清白蛋白 | 66200 | 4.820858 | 1．48 | 0.344186 |
兔肌动蛋白 | 43000 | 4.633469 | 2．2 | 0.511628 |
牛碳酸酐酶 | 31000 | 4.491362 | 2．85 | 0.662791 |
胰蛋白酶抑制剂 | 20100 | 4.303196 | 3．6 | 0.837209 |
鸡卵清溶菌酶 | 14400 | 4.158363 | 4．2 | 0.976744 |
| | | | | |
标准曲线绘制如下：
即标准曲线为：㏒Mr=5.20519-1.07931*m
2.计算样品分子量
样品迁移率记录如下表：
类别 | 样品迁移距离（cm） | 染料迁移距离（cm） | 相对迁移率 | 分子量 |
天花粉蛋白 | 3.05 | 4.3 | 0.7093023 | 27519 |
胰蛋白酶 | 3 | 0.6976744 | 28326 |
人血清白蛋白 | 1.45 | 0.3372093 | 69380 |
牛血清白蛋白 | 1.46 | 0.3395349 | 68981 |
| | | | |
三．分析与讨论
1.影响蛋白质和SDS结合的因素主要有：①二硫键是否被完全还原，只有在蛋白质分子内二硫键被彻底还原的情况下，SDS才能定量结合到蛋白质分子上，并使之具有相同的构象，
一般以巯基乙醇作还原剂；②溶液中SDS的总量至少比蛋白质高三倍，一般需高达10倍以上；③溶液中的离子强度应较低，最高不超过0.26，所以样品要经透析处理。
2.在凝胶电泳中影响迁移率的因素有很多，而在制胶和电泳过程中，很难每次都将各项条件控制的完全一致。因此，用SDS凝胶电泳测分子量，每次测定样品必须同时做标准曲线，而不得利用另一次电泳的标准曲线。
3.凝胶电泳所用试剂要求严格，需准确配制。
4.胰蛋白酶在pH3.0下稳定，但透析后容易自容，所以上样时应尽量多一些，大约30-40uL。
附：
1. 样品溶解液（2×） 2.脱液
3.电极缓冲液（5×）
Tris 7.57g
Gly 36.03g
10%SDS 25.0mL
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议