可溶性蛋白质含量的计算需要用实验方法:
一g蛋、配制试剂
标准蛋白质溶液:称取0.1g牛血清蛋白,加蒸馏水溶解并定容至100ml,即为1000ug/ml 标准液。吸取上述溶液1ml,加入10ml容量瓶并加蒸馏水定容,可获得100μg/ml 标准液。4℃下保存备用。或称取0.25g牛血清蛋白,加蒸馏水溶解并定容至100ml。吸取上述溶液40ml,用蒸馏水稀释至100ml即可。4℃下保存备用 考马斯亮蓝G-250溶液:称取0.1q考马斯亮蓝溶于50ml90%乙醇中,加入质量浓度85% H3PO4 100ml,再用蒸馏水定容至1000ml,过滤,贮存于棕瓶中,常温下可放置1个月。
质量浓度85%H3PO4 100ml。
二、标准曲线制作
取6支10ml具塞试管标号,按下表加入各种试剂。加完试剂后盖上玻璃寒,摇匀。放置5 分
钟,在595nm波长下比测定,1h内完成比。以牛血清清蛋白含量为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线或求回归方程。
三、蛋白质提取
称取叶片0.2g,放入研钵中,加入少许石英砂和蒸馏水研磨成匀浆,转入10ml容量瓶定容至刻度。取3ml匀浆于离心管中,5000g下离心10分钟,上清液即为蛋白质提取液。
准确吸取上述蛋白质提取液0.1ml,放入具塞刻度试管中,加入0.9ml蒸馏水和5ml考马斯亮蓝试剂,充分混合,放置2 min后在595nm比,记录吸光值,并通过回归方程计算蛋白质含量,比的空白对照为1ml蒸馏水+5ml考马斯亮蓝试剂。
四、注意事项
比应在出现蓝2min-1h内完成,每一批要做一组标曲。
五、可溶性蛋白质含量的计算
根据所测样品提取液的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量(),按下式计算:样品中蛋白质含量:
C:查标准曲线值;VT为提取液总体积/ml;FW为样品鲜重/g;VS为测定时取用提取液体积/ml;1000:将换算成mg。