实验二：分光光度计的学习之考马斯亮蓝G-250法（Bradford法）测定蛋白质含量定
一 实验目的
学习分光光度计的基本原理和使用方法，并使用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量。g蛋
二 实验原理
考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250 在游离状态下呈红，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青，蛋白质-素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合在2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h 内保持稳定。该法是1976年Bradford 建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry 法还高4
倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
三 实验材料
1. 实验材料：未知浓度的牛血清样品
2. 主要仪器：试管、移液、分光光度计等。
3. 试剂：蛋白试剂考马斯亮蓝G-250 的配制：称取100mg 考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL。此溶液在常温下可放置一个月。
四 实验步骤
标准曲线制作：取6 支10mL 干净的试管，按表1 取样。摇匀后放置2min ，用1cm 光经的比杯在595nm 波长下比，记录测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。
表1 低浓度标准曲线制作
管号 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
1mg/ml标准蛋白(ml) | 0 | 0.02 | 0.04 | 0.06 | 0.08 | 0.10 |
蒸馏水(ml) | 1.0 | 0.8 | 0.6 | 0.4 | 0.2 | 0 |
考马斯亮蓝G-250（ml） | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
蛋白浓度（mg /ml） | 0 | 0.02 | 0.04 | 0.06 | 0.08 | 0.10 |
OD595nm | 0 | 0.339 | 0.491 | 0.601 | 0.775 | 0.799 |
| | | | | | |
上图数据标准曲线如下：
拟合标准方程：y=7.7329x+0.1142
2．未知蛋白质浓度的测定
另取2 支10mL 试管，按下表取样。吸取测定液0.1mL，蒸馏水0.9 mL放入试管中，加入5mL 考马斯亮蓝G-250 蛋白试剂，充分混合，放置2min 后用1cm 光径比杯在595nm 下比，记录光密度OD595nm，并通过标准曲线查得待测品提取液中蛋白质的含量X（μg）。以标准曲线0号试管做空白。
五 实验结果
待测样品的吸光度1为0.240，待测样品的吸光度2为0.266，平均值为0.253。代入标准曲线得知x为0.0018，所以浓度为0.018 mg /ml。
六、实验分析
（一）经测量得每毫升测定液中蛋白质的含量很低，是样品本身蛋白含量少还是实验操作造成，还需进一步分析。
（二）考马斯亮蓝法测定未知蛋白浓度：
优点：1、灵敏度高；
2、测定快速、简便，只需要加入一种试剂；
3、干扰物质少。
缺点：一般分光光度法都有较大的机器误差（重复性较差），为了数据准确，需要每次进行标准曲线的测定。
七、注意事项
1.在测量前应把分光光度计预热半小时，打开开关时，先确定开关按钮的置，切不可凭直觉乱摸。
2.称量样品前，电子天平要归零，称量时要精准。
3.溶液一定要配制准确,以防影响实验效果,保证点在一条直线上。
4.在作标准曲线进行定量前一定要选择最大的吸收波长,确保灵敏度高。
5.在实际操作中，比皿在使用中应注意保持干净，更不能触摸比皿的光面，以防摩擦影响通光。
（注：专业文档是经验性极强的领域，无法思考和涵盖全面，素材和资料部分来自网络，供参考。可复制、编制，期待你的好评与关注）
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