【实验研究】
光明中医2021年5月第36卷第9期CJGMCM May 2021. Vol 36.9• 1431•香菇多糖抑制肝癌细胞HePG2增殖的作用及其可能机制 李永格
摘要：目的探讨香菇多糖（Lentinan.LNT)对肝癌细胞HePG2增殖的影响及机制。方法体外培养肝癌细胞系HepG2分别给予不同浓度LNT处理，MTT法检测肝癌细胞增殖抑制率的变化，weS tern-bl〇t检测轴突导向蛋白4C(Sema4C)和G蛋白偶联受体激酶相互作用蛋白1(GIT1)表达。结果不同浓度LNT作用肝癌细胞24、48、72 h后，肝癌细胞增殖的抑制率呈现浓度和时间依赖性；westem-blot检测发现100 (ig/m l香菇多糖处理肝癌细胞48h后，Sema4C和G1T1表达明显低于对照组（P <0. 05 )。结论LN T 能够抑制肝癌细胞增殖，其机制可能是通过下调Sema4C和GIT1蛋白表达。 关键词：香菇多糖；肝癌；轴突导向蛋白4C;G蛋白偶联受体激酶相互作用蛋白1
doi： 10.3969/j. issn. 1003-8914.2021.09.023 文章编号：1003-8914(2021)-09-1431>02
肝癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，在我国发病率非常高，居所有恶性肿瘤的第2位。肝癌的多通过手术切除、肝脏移植以及化疗等综合疗法，虽然取得了一定进展但预后还是很差，导致其5 年生存率
不足5%[1’2]。中草药在防治肝癌复发、转 移，延长生存期方面具有明显优势。香菇多糖(Leminan，LNT)是从香菇分离出来的最有效的活性物质，有研究表明其对肝癌细胞有明显的直接抑制
作用[3]，但具体机制不清。本课题拟通过不同浓度LNT体外作用于HePG2肝癌细胞系，观察肝癌细胞增殖变化；western-b lo t检测轴突导向蛋白4C (Sema4C)和G蛋白偶联受体激酶相互作用蛋白1 (GIT1)表达，分析其作用的可能机制。
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1细胞株人肝癌细胞系HePG2购自中国科学院细胞库。
1.1.2药品及试剂LNT购自武汉胜天科技有限公司，（批号：1541023)；四甲基偶氮唑盐（MTT)购自美国Sigma公司；10%胎牛血清；DMEM培养基（美国Invitrogen公司）；抗体（武汉博士德）；其他试剂均为国产分析纯或化学纯。
1.2 实验方法
1.2.1细胞培养人肝癌细胞系HePG2采用10%胎 牛血清、100 U/m l青霉素和100 U/m l链霉素的高糖D
MEM培养基作常规培养，其中培养温度保持37丈、C02含量5%，取生长良好并处于对数生长期的细胞用于下述实验。*
*基金项目：河南省南阳市科技攻关项目（NO.KJGG2018106)
作者单位：南阳医学高等专科学校基础医学部（河南南阳473000) 通讯方式：E-mail:***************************1.2.2M T T法检测L N T对细胞增殖抑制率的影响
LNT采用完全培养基配置成6.25、12.5、25、50、100j j L g/ml浓度。根据不同浓度LNT将肝癌细胞分为以下几组:①对照组：完全培养基作用5 h;②6.25 pg/ml LNT组：完全培养基联合6.25 (xg/ml LNT作用5 h;
③12. 5叫/m l LNT组：完全培养基联合12.5叫/ml LNT 作用5 h;④25叫/m l LNT组：完全培养基联合25叫/m l LNT作用5 h;⑤50 jjig/ml LNT组：完全培养基联合50 jjig/ml LNT作用 5 h;⑥100 pg/ml LNT组：完全培养 基联合100 pg/ml LNT作用5 h。将细胞按每孔5 x 105个接种于96孔板中，各组分别设置5个重复孔，加人不 同浓度LNT处理5 h后洗去上清液，然后加人完全培养基，向每孔中加人20 pj MTT溶液（浓度为5 mg/ml，用 PBS配），37 ^培养4 h后吸去上清，加人200 (xl DMS0溶液，振荡20 min，使细胞充分溶解，在OD 490 run处 通过酶标仪检测其吸光值并记录。参照上述方法，每 隔24 h检测1次细胞增殖情况，共计3次。
1.2.3western-blot 检测 GIT1 蛋白、Sema4C 蛋白在 肝癌细胞株中表达根据MTT结果选取100 pg/ml LNT组肝癌细胞与对照组细胞进行western-blot实验。参照试剂盒说明书裂解细胞，提取总蛋白并进行蛋白定量。灌制10%SDS-PAGE凝胶，每孔上样30叫，250 V转移至聚偏二氟乙烯膜，于37 °C置5%脱脂奶粉封闭液中封闭1h。滴加一抗,4 °C孵育过夜,37 °C 下与HRP标记的二抗孵育l h，洗涤后ECL曝光。同 样的方法对P-actin进行检测并作为内参对照。所得图像用凝胶成像系统进行分析，以目的基因灰度值/内参P-actin灰度值半定量计算蛋白含量。
1.2.4统计学方法计量资料用均数±标准差（元士s)表示，并用SPSS 13.0统计学软件进行处理，组间比较用《检验，P<〇. 05为差异有统计学意义。
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2 结果 现为量效、时间依赖性，100 LNT作用48 h后，2.1不同浓度L N T对HepG2细胞增殖影响不同 细胞生长出现半抑制，故选择100 jxg/ml LNT作用浓度LNT对HePG2细胞增殖都有明显抑制作用且表48 h来进行后续研究。见表2。
表1不同浓度L N T对HepG2细胞的抑制作用（例，i±s)
LOT不同浓度/U g/m l)
作用时间---------------------------------------------------------------------------------------------------
6. 2512. 52550100
24h10. 51 ±2. 5614.53 ±3. 6219. 52 ±4. 3626. 03 ±3.0235.08 ±5.01
48h20. 36 ±2. 1226. 12 ±2. 1332. 13 ±4. 3240. 12 ±5.0150. 36 ±5. 13
72h27. 36 ±2. 3136. 21 ±4. 3246.35 ±5.2357. 18 ±6. 2870. 13 ±6. 96
2. 2 western-blot检测LNT作用后HepG2 细胞Sema4C、GIT1蛋白表达应用western-blot检测100 pg/m l LNT 对 HepG2 细胞Sema4C 蛋白、GIT1蛋 白表达的影响，结果显示：1〇〇pg/m l LNT组HePG2细 胞Sema4C蛋白、GIT1蛋白相对表达量明显低于对照组<0. 05)，提示100 (xg/ml LNT 下调 HepG2 细胞Sema4C蛋白与GIT1蛋白表达。见表2、图1、图2。
对照组LNT组
g iti m t m m m m
々-actin
图1GIT1蛋白表达电泳图
对照组LNT组
/?-actin W H P
图2 Sem a4C蛋白表达电泳图
表2Sema4C、G I T l蛋白相对表达量(X± s)
组别Sema4C GITI
对照组0.95 ±0. 120.98 ±0.07
LNT组0.21 ±0. 05n0. 23 ±0. 04u
注：与对照组比较，U PcO.O S。
3讨论
多糖是构成生物体的重要组成部分，具有增强免疫、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老等作用4’5]，尤其是抗肿
瘤的作用成为现在研究的热点。目前关于多糖抗肿瘤的作用机制还不清楚，多数研究集中在免疫调节方面。本实验室前期体外实验研究发现LNT能够抑制肝癌细胞的生物学行为[6~，说明LNT抗肿瘤作用可能通过其他途径产生。本实验通过MTT法检测肝癌细胞增殖，发现不同浓度LNT对Huh7.5. 1细胞增殖有明显抑制作用且表现为量效、时间依赖性，与前期研究结果相符。
Sema4C为SemalV亚族一员，有报道表明常见恶性肿瘤乳腺癌、子宫内膜癌和前列腺癌组织和细胞水平上均见Sema4C较强表达，且肿瘤细胞转移潜能不同，Sema4C蛋白表达的强弱是有差别的[8]。因此，推
测Sema4C在人类恶性肿瘤的表达可能具有普遍意
义，并且与恶性肿瘤的侵袭和转移密切相关。G蛋白
偶联受体激酶相互作用蛋白1(G protein coupled receptor kinase interacting proteinl,GITI )为 GIT 家族
分子，被 N-ot-乙酰转移酶 10(N-a-acetyhransferasel0，NAA10)干扰作用后，抑制肿瘤的转移[9]，提示GITI
蛋白可能是肿瘤转移的促进因子。通过western-blot
研究发现LNT组肝癌细胞Sema4C蛋白和G ITI蛋白
表达明显低于对照组（P <〇.〇5)，说明LNT下调肝癌
细胞Sema4C蛋白和GIT1蛋白表达。
综上所述，LNT抑制肝癌细胞增殖，其机制可能通
过下调SEMA4C蛋白和GIT1蛋白表达来发挥作用，
为LNT肝癌作用机制提供新思路。
参考文献
[1 ] FONSECAAL, CHACH. Hepatocellular carcinoma：A comprehensive
overview of surgical therapy I J ]. J Surg Oncol, 2014, 110 ( 6 )：
712-719.
[2] SONG MJ, BAE SH. Newer treatments for advanced hepatocellular
carcinoma[ J ]. Korean J Intern Med, 2014,29(2)：149-155.
[3]桂明杰，亢学平，王鑫，等.香菇多糖对HePG2及H22肿瘤细胞的
抑制研究[J]•食用菌，2015,37(5) :63名5.
[4] ZHANG Y Y, LI S, WANG X H, et al. Advances in lentian：
Isolation , structure, chain conformation and bioactivities [ J ]. Food
Hydrocolloid, 2011 , 25(2) ：196-206.
[5]陈福禄，谢宝贵，郑金贵.药用菌多糖的药用功能与展望[J].中
国药学杂志，2005，40 (4) : 244 -248 •
[6]张冬，李永格.香菇多糖对肝癌细胞Huh7.5. 1增殖和侵袭的影
响[J].中医药临床杂志，2017,29(9) :1467-1469.
[7]李永格.香菇多糖对肝癌细胞Huh7.5. 1增殖的影响[J].中医
研究，2017,30(5) :72-74.
[8]陈颖，张磊，刘文欣，等•SemaphoriMC在乳腺癌子宫内膜癌及前列g蛋
腺癌中的表达及意义[J].中国肿瘤临床，2010,37(9) :507-511.
[9] HUA K T, TAN C T, JOHANSSON G, et al. N-a-acetyltransferaselO
protein suppresses cancer cell metastasis by binding PIX proteins and
inhibiting Cdc42/Racl activity [ J ]. Cancer Cell, 2011, 19(2)：
218-231.
(本文校对：刘庆春收稿日期：2020 -07 -10)
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