ProteinA是一种金黄葡萄球菌细胞壁蛋白质,能特异性地与人和哺乳动物抗体(主要是IgG)的Fc区结合。因而,将ProteinA与琼脂糖凝胶以一定的方式结合,可制备用于抗体纯化的亲和填料。 早期的ProteinA柱结合的都是天然ProteinA。天然ProteinA由5个IgG结合域和其它未知功能的非Fc结合域组成,分子量约42KD,结构如图1所示。这种柱子对IgG的亲和能力很强,可以吸附大量的lgG。但同时,天然ProteinA的其他非结合域会和非目标蛋白结合,这样被洗脱下来的蛋白质纯度不够,会影响到后续的试验。 为了解决这些问题,科学家们运用基因工程技术,克隆出ProteinA的基因,并对其进行改造,除去了一些不重要的非结合域。偶联这种重组ProteinA的琼脂糖凝胶柱在蛋白质纯化中,的确是提高了产物的纯度。目前,市场上绝大部分重组ProteinA柱都是这种产品。但是,纯化时所用的洗脱液一般为pH=2.7的甘氨酸溶液,如果洗脱效果不是很理想,还要降低pH,采用pH=1.9的甘氨酸溶液。由此可见,此法洗脱条件比较剧烈,最后收集的蛋白质很有可能变性,或者是复性困难。 这种洗脱条件剧烈的ProteinA柱结合的重组蛋白质A一般具有5个串联结构域:E、D、A、B、Cg蛋。这种重组蛋白A虽然除去了不重要的非结合域,仅由5个结构域组成,每个域均可以和IgG的Fc段结合,但不同的域结合强度略有差异。因此洗脱条件不均一,而且经常需要较低的pH值。如果减少串联结构域的个数,并且采取同型结构域串联,就可以避免不同结构域与抗体Fc段亲和性的差异,洗脱条件会温和而均一。为此,我们可以做一个试验,比较一下这两种蛋白质A柱纯化的结果。 待纯化样品:人血浆 实验材料: GE公司的rProteinASepharoseFF(E、D、A、B、C结构域串联) Putus公司的rProteinASepharoseFF(3个B结构域串联) 实验方法: 分别按照每个公司的说明书来操作,洗脱条件分别为pH值3.0和4.5,SDS-PAGE检测结果如下:
上图从左边起,泳道1为标准蛋白Marker,泳道2为经过GE填料洗脱后抗体,泳道3为经过Putus填料洗脱抗体,泳道4为人血浆。从图中,我们可以看出,与拥有5个异型结构域的rProteinASepharoseFF填料从人血浆纯化抗体纯度比较,拥有3个同型结构域的填料纯化的抗体纯度更高。更重要的是,后者的洗脱条件仅为4.5,高于前者的洗脱条件3.0。使用具备较少B结构域的ProteinA柱能获得高纯度的IgG,并且洗脱条件温和,从而能防止蛋白质聚集,保护蛋白质活性。 | |||||||||||
本文发布于:2024-09-22 17:35:33,感谢您对本站的认可!
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