目录
引言 (2)
1.1 农杆菌介导法 (2)
1.2 基因法 (3)
1.3 花粉管通道法 (3)
1.4 电击法 (4)
1.5 PEG介导法 (4)
2. 苜蓿遗传转化研究进展 (4)
2.1 苜蓿遗传转化的研究现状 (5)
2.2 苜蓿遗传转化的应用 (5)
2.2.1 苜蓿遗传转化在提高非生物胁迫的应用 (5)
2.2.2 苜蓿遗传转化在提高生物胁迫的应用 (6)
2.2.3 苜蓿遗传转化在品质改良方面的应用 (8)
3. 苜蓿遗传转化研究趋势 (8)
4. 结语 (8)
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引言
紫花苜蓿是世界上分布最广的多年生豆科植物之一。在中国，它也是一个最重要的豆科牧草。它不仅产量高，而且营养丰富。但是，随着草地盐渍化程度的加剧、草地生态环境的破坏和草地植被的严重退化，应培育大量的新品种，以满足草地畜牧业对牧草生产的需求。传统的选育抗盐、抗旱、抗病昆虫的育种方法具有长期、缓慢的不利因素。利用转基因技术培育苜蓿抗性新品种是牧草育种中最有效 苜蓿根
的方法。1986年，农杆菌促成的首例苜蓿转化成功。近10年来，苜蓿转基因研究取得了很大进展，本文综述了近十年来苜蓿转基因研究。
1. 苜蓿转基因技术研究现状
1.1 农杆菌介导法
农杆菌是一种土壤中的革兰氏阴性杆菌，主要分为发根农杆菌和分根癌农杆菌两类，它们可以通过伤口和伤口浸染植物冠瘿和毛根。农杆菌介导法是植物转基因工程发展最为明显、最成熟、应用最广泛的方法。它吸收自然转化机制的优点，消除了大量的T-DNA区基因，使其失去其致瘤性，并可以在感染植物的伤口把T-DNA转移到受体植物的基因组。早在1986年初，Deak 等以苜蓿茎段为外植体，通过农杆菌介导的方法导入紫花苜蓿，并获得转基因植株。1985年，horsh 等以叶片为外植体，和农杆菌介导的叶盘转化法成立，扩大了农杆菌侵染受体使用。1988年，Chabaud等用农杆菌介导叶和苜蓿叶柄感染表明，农杆菌种类及共培养时间均影响苜蓿遗传转化的重要因素。Hill等用农杆菌介导的转化编码苜蓿花叶病毒外壳蛋白基因转入不同品种的苜蓿，并对再生植株喷涂AMV病毒，发现转基因苜蓿比野生型苜蓿抗AMV强。1992年，Wandelt 等介绍了豌豆蛋白基因导入苜蓿根癌农杆菌介导法。转基因苜蓿的球蛋白含量提高到0.1%，是普通苜蓿的20倍。Tabe等用根癌农杆菌介导的葵花籽蛋白基因转入苜蓿的引入，使转基因苜蓿蛋白含量占叶片可溶性蛋白的0.1%。近年来，国内已经在农杆菌介导苜
蓿转化方面获得巨大的进步。2002年，黄剑成功地建立了苜蓿高频再生体系。在农杆菌介导法的基础上，将甜菜碱醛脱氢酶基因导入苜蓿，获得转基因耐盐苜蓿。金树梅与苜蓿子叶为外植体，农杆菌介导的转化Gus基因转入某一种苜蓿中。曹致中等利用农杆菌介导法，建立了“中苜一号”紫花苜蓿的遗传转化体
系，进一步优化了基因的反应条件。梁慧敏等用农杆菌介导BADH基因导入苜蓿。经格斯组织化学染和pcr检测，获得了26株抗性再生苜蓿。吕德洋利用农杆菌介导的方法，将富含氨基酸的蛋白质基因导入紫花苜蓿，转基因植株中氨基酸含量的测定明显高于野生型植株。与其他转基因方法相比，农杆菌介导法不仅易于操作，而且大多数基因在单位点被整合到植物基因组中，有利于基因表达。因此，它是植物转基因研究中最常用的方法。不同基因型苜蓿对农杆菌的敏感性不同，导致遗传转化的重复性较差。由于不同的再生和转化位点，“嵌合体”的问题还有待于进一步研究和解决。
1.2 基因法
基因法又称微弹轰击法，首先由桑福德提出并建立了一个高效的基因转化方法，其原理是将外源基因包裹在一个直径约1 ~ 2毫米钨或金颗粒表面，通过加快植物外植体的轰击，穿透植物细胞壁和细胞膜和外源基因进入植物体内的细胞。该方法操作简单，转换效率高，受主材料来源广。1995年，Pereira和其他将军轰击方法载体的NPTⅡ基因在不同的7个苜蓿品种，并发现基因已整合到苜蓿基因组，
发现基因型不影响苜蓿基因型。拉迈亚和其他格斯基因成功导入苜蓿花粉结构通过基因的方法和在转基因植物中的表达。在f1代基因序列分析中，F1代幼苗中有30%具有格斯基因。在中国，王莹等对“中苜一号”苜蓿愈伤组织为靶细胞的基因将lea3基因在紫花苜蓿，经筛选获得了草铵膦抗性愈伤组织，导致抗性植株，发现转基因植株具有较强的耐盐性。与农杆菌介导转化相比，基因转化的频率仍然较低，所引入的基因序列和数量特性不强，可能导致植物基因表达异常。然而，一般来说，基因打靶的方法仍然是一种很有前途的基因转化方法。
1.3 花粉管通道法
花粉管通道法首先是由周光裕提出的。这种方法为植物生物的基因转化开辟了一条新的途径。其原理是在授粉过程中向子房注射含有目标基因的溶液。在受精过程中，植物将外源基因导入受精卵，并进一步整合到受体细胞基因组中。随着受精卵的发育，将获得一个具有靶基因的个体。该技术避免了复杂繁重的工作，操作简单。1988年，罗等人首先介绍了目标基因转入水稻用花粉管通道和
Southern杂交和酶活性测定表明，外源基因已整合到水稻基因组并表达。在中国，牛一丁报告质粒载体含基因阿尔冈金苜蓿体内通过花粉管通道法引入PCR 和southemblot检测表明，外源基因已整合到苜蓿基因组。张立全等将盐生植物红树的总DNA通过花粉管通道导入紫花苜蓿，并成功获得的转基因植物。pcr检测表明外源DNA已在转基因植株中表达。花粉管通道法的缺点是导入外源基因片段的转化
植株可能有少量的没有目的性状的基因片段，只能用于开花植物，只有开花期才能转化。目前，外源基因整合的机制还不清楚，转换频率低，重复性不高。相信随着研究的深入，花粉管通道技术和相关理论将更加完善，可以更广泛地应用于植物转化的研究。
1.4 电击法
电击也叫击穿孔法，是高速电脉冲在植物细胞壁上开孔使用，基因可以通过微孔进入细胞，并整合到受体植物的基因组，但细胞本身的生理活性不受影响，且操作简单，转化率高效率，特别适合于研究瞬时表达。在国际植物分子生物学会议上，李宝剑报告了电击法的应用结果。此后，电休克法已成功地应用于烟草、小麦、玉米、大豆、马铃薯、水稻等作物的遗传改良试验。1992年，Deineke 等采用电击将基因转化人干扰素基因转入苜蓿体，38代转基因植株获得成功。在国内，黄少星等方法通过电击直接将格斯基因导入苜蓿原生质体中，检测到外源基因被完全表达，获得了转基因植株。
1.5 PEG介导法
PEG（Polyethylene glycol，聚乙二醇）介导的转化是化学转化的方法，由Davey和Krens创立的，这种方法的原理是通过复方聚乙二醇聚鸟氨酸L-钙磷在碱性条件下能促进细胞膜的内吞作用时，原生质体诱导外源基因的摄入基因与植物基因组整合的目的。基因转化的方法是反复强势，并从细胞团原生质体的形成是容易选择，嵌合体少，但植物原生质体再生系统多数是难以建立，即使建立再生体系植
物原生质体仍然存在基因型效应、原生质体培养、长周期运行繁琐，严重限制了该方法的应用。
2. 苜蓿遗传转化研究进展
2.1 苜蓿遗传转化的研究现状
目前，利用分子生物学育种技术提高紫花苜蓿的品种特性是世界苜蓿研究的主要方向。研究内容包括：基因克隆、表达载体、启动子和标记选择、转基因植物的高表达特性和田间释放安全性问题，转基因苜蓿带来了知识产权和产业挑战。同时，巨大的进步和突破已经在苜蓿转基因育种，如苜蓿抗膨胀病、抗除草剂、抗病虫以及延缓植物木质化过程来提高苜蓿质量。
在发达国家，转基因技术已广泛应用于苜蓿、苜蓿等多个领域，在抗病育种、减少病害、提高干物质消化率、生物降解材料开发、生物土壤、生物活性和疫苗制剂等方面取得了进展和突破。在国外的转基因苜蓿的主要研究方向：利用基因工程技术对苜蓿冷抗寒基因表达的广泛研究；转基因紫花苜蓿植物紫花苜蓿抗寒性的调节；技术提高抗洪水的能力；休眠；开展基因的表达及转基因苜蓿研究调节等。利用低温诱导特异蛋白调控抗旱特性、相关基因的克隆和基因转化等方面的研究取得了一定进展。在低温诱导苜蓿已在具体的防冻蛋白合成的观察，苜蓿和其他材料已被分离和鉴定的低温诱导基因表达调控的低温诱导抗旱、抗寒性的表达是一种新型的电流抗性育种理念。随着生物技术的发展，国内外许多国家获得了许多转基因植物，在改善生态环境方面发挥了重要作用。总之，国内外报道的
转基因基因包括抗病性、抗虫性、抗除草剂性、品质改良、固氮和抗逆性。目标基因的导入主要是通过遗传转化实现的。外源基因可直接导入DNA，农杆菌介导的转化和花粉管通道法。
2.2 苜蓿遗传转化的应用
苜蓿在其他国家的畜牧生产中占有十分重要的地位。与其他牧草相比，紫花苜蓿转基因研究早、范围广、成功案例多。苜蓿遗传转化的内容也非常广泛，包括品质改良、除草剂抗性、抗病性、抗病性等。
2.2.1 苜蓿遗传转化在提高非生物胁迫的应用
在抗寒突变体的筛选通过红报告，苜蓿叶片愈伤组织诱导的（在1个月左右，诱导传代不超过3代）突变试验材料，用EMS诱变筛选，成功获得抗寒性突变体。此外，许多研究表明生物和非生物胁迫都与活性氧有关。超氧化物歧化酶（SOD）能消除活性氧对细胞膜的损伤。Mckersie 等用烟草锰超氧化物歧化酶C
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