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ＲｅＳｅａｒＣｈＰａｐｅｒＳ研究快报
谢海龙，）”陈主初２）李金花・’
（１）南华大学肿瘤研究所，衡阳４２１００ｌ：２）中南大学肿瘤研究所，长沙４１００７８）
摘要却ｇｅａｌｃａｒｃｉｎｏ眦ｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅ１（Ｌｃ尺ＧＪ）是一个喉癌候选抑瘤基因，为进一步深入研究其转录调控机制，应用５’ＲＡｃＥ技术确定了该基凼的转录起始位点，然后在对人￡ｃＲＧＪ基因进行生物信息学分析的基础上，通过ＰｃＲ定向克隆和酶切业克隆策略，构建了１１种含不同长度ＬｃＲＧＪ启动子荧光素酶报告基凶重组体．启动子活性分析表明，一１６９～＋１２７区域的启动子活性最高．研究提示，ＬｃＲＧＪ基因转录所必需的基因启动子序列在一１６９～＋１２７范围内． 关键词￡ｃ尺ＧＪ，喉癌，启动子，转录调控
学科分类号Ｑ７４
喉癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤，是由遗传和环境等诸多因素相互作用所致，涉及到大量相关基因结构和表达调控的改变，尤其是瘤基因的活化和抑瘤基因的失活起到关键性作用，但喉癌发病的分子机制至今仍不清楚【Ｉ，２Ｊ．因而分离和鉴定与喉癌发病相关的基因将是阐明其癌变机制与易感性的关键，对其临床诊断和也有较重要的意义．我们在２０００年采用ｍＲＮＡ差异显示和ｃＤＮＡ文库筛选技术，克隆了在喉癌组织中表达下调新基因￡ＣＲＧＪｆ（ＧｅｌｌＢａｌｌｋ登录号为Ａｆ２６８３８７）【３卅．将￡ｃＲＧＪ基因转染到喉癌细胞Ｈｅｐ．２中，发现￡Ｃ兄ＧＪ能显著抑制移植瘤的生长同．研究发现，Ｌ积ＧＪ表达水平的改变是喉癌发病的重要因素，而￡ＣＲＧＪ『转录调控的机制目前尚不清楚．因此，本研究利用５，ＲＡＣＥ确定￡衄Ｇ，转录起始位点，克隆人己ｃ尺ＧＪ『基因５７调控区并对其功能进行了初步分析．
１材料与方法
１．１材料
ＣＯＳ７细胞株购自美国ＡＴＣＣ公司；人肝癌细胞７７２ｌ为本实验室保存；ＤＭＥＭ、胎牛血清购自Ｈｙｃｌｏｎｅ公司；Ｔａ勋ＲａＬＡＴａｑ。、ＴａＫａＲａ５，．ＦｕｌｌＲＡＣＥ鼢ｔ（Ｃｏｄｅ№．Ｄ３１５）购自ＴａＫａＲａ公司；ＰＣＲ产物克隆载体ｐＣＲ２１１ＴＯＰ０ｖｅ ｃｔｏｒ购自Ｑｉａｇｅｎ公司；用于启动子活性分析的ＰＧＬ３系列质粒及荧光素酶内参照质粒ＰＩ也一ＴＫ购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；ＤＮＡ转染试剂Ｌｉｐｏｆｃｃｔａｍｉｎｅ２０００购自Ｉｆｌ讥仃ｏｇｅｎ公司；双荧光素酶检测试剂购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；质粒提取试剂盒购白Ｑｉａｇｅｎ公司；各种限制性内切酶、ＤＮＡ连接酶、胶纯化回收试剂盒均购自ＴａＫａＲａ公司；实验中所用引物用Ｐｒｉｍｅｒｐｒｅｍｉｅｒ３软件设计，由上海英骏技术公司合成．ｐｃＤＮＡ３．１／Ｓｐｌ表达质粒（上海市肿瘤研究所朱景德教授惠赠）．
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１．２方法
１．２．１转录起始点的确定．
ａ．已知序列验证．根据￡ＣＲＧ，已知序列∞ｅｎＢａｎｋＮｏ．ＡＦ２６８３８７）设计验证用引物．Ｔｒｉｚｏｌ法提取培养正常喉黏膜细胞中的总Ｉ矾Ａ．先用ＤＮａＬｓｅＩ消化总ＲＮＡ中的痕量ＤＮＡ：反应总体积５０肛ｌ，总ＲＮＡ１０斗ｇ，ＤＮ嬲ｅＩ５Ｕ，ＲＮａｓｉｌｌ５０Ｕ，１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ—ＨＣｌ（ｐＨ８．３），１０ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ：，３７℃消化３０ｍｉｎ．苯酚氯仿抽提，乙醇沉淀，ＤＥＰＣ处理水溶解，紫外分光光度计测定Ｉ矾Ａ浓度．取总ＲＮＡ４４９，按ＲｅｖｅｒｓｅＴ啪ｓｃ坤ｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ提供的操作程序进行逆转录反
’国家自然科学基金资助项目（３０５７２０３０）．
”通讯联系人．
Ｔｅｌ：０７３４－８２８１５ｌＯ，Ｅ－ｍａｉｌ：】【ｈｌ００７８＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ．ｃⅡ
收稿日期：２００７．１０．３０，接受日期：２００７．１２．１６
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