安徽医科大学学报Ada Universitatis Medicinalis An,aut202)Feb;56(0)・227•网络出版时间：2020-17-251)：1)网络出版地址：http s：//b nemkcms/d emk/34.1465.R.20201224.1146.712.html
miR-33-5p靶向调控JNK1/c-Jun通路降低
韩永洁1王兴国0邓璐1杜蔚蔚-
摘要目的探讨mlRR8Rp调控c-Jun氨基末端激酶-(JNK)-通路对人口腔鳞状细胞癌多重耐药性的影响。方法CAL-27细胞分为CAL-27组,CAL-27/LBP组、CAL-57/ CBP+scramble inUibitos组、CAL-27/CBP+miRR3Rp indiPi-J”组，卡钳(CBP)诱导耐药细胞株，根据组别转染scramble inUibitos或miR-33-5p indibitos,MTT检测细胞的多重耐药性,RT-PCR检测mlRR8Rp的表达，荧光素酶报告实验检测miR-33-5p和JNK)靶向作用，Western blot检测JNK)/c-Jun 通路的激活以及MDR)的表达，流式细胞术检测Rhl23聚集结果。结果与CAL-27组比较,CAL-27/CBP的多重耐药性提高(P<0.0)-,miRR8Rp表达水平升高(P<0.6)), JNK)/cNun通路活化水平降低(P<0.0I),Rhl23阳性细胞百分比降低(P<0.0I),MDR)蛋白水平升高(P<0.0I)，同时荧光素酶报告实验结果显示mlRN8Rp靶向作用于JNK)；与CAL-27/CBP组比较，CAL-27/CBP+miRN3Np in-hibitor组细胞的多重耐药性降低(P<0.65),miRR3Rp表达水平降低(P<0.6)),JNK)/cNun通路活化水平升高(P< 0.0I),Rhl23阳性细胞百分比升高(P<0.0)),MDR)蛋白水平降 低(P<0.6)) o结论miRR3Rp通过靶向调控JNK)/cNun通路降低CAL-27/CBP耐药细胞株的多重耐药性。
关键词口腔鳞状细胞癌；多重耐药性;JNK)；miRN3Np
中图分类号R739.8
文献标志码A文章编号1000-1492(202))02-0227-06 doi：10.i.iss/1400-1420.200).P0.71)
口腔癌是全球最常见的十种癌症之一，尽管研究和不断取得新的进展，但在过去几年中生存率并未显著提高[-]o化疗是口腔癌的主要方法之一，然而肿瘤细胞对化疗药物产生的耐药性是影响该方法疗效的主要难题[0]o肿瘤多重耐药有着复杂的机制，多重耐药基因(multibmp resistance gene1,MDR1-表达产生的P糖蛋白(P-glycouro-teiu,P-gp)是其中的关键因子2]o0-]”氨基末端激 2220-3-12接收
基金项目：青海省卫生健康委员会课题(编号：2017-wjz3x-03)
作者单位：青海省人民医院1颌面外科、肿瘤内科，西宁317027作者简介：韩永洁，女，副主任医师，责任作者，E-mail：han_ 002aaalll@172 酶(cNnu N-terminal kinase,3NK-，在诸多文献中报道了其与多重耐药性的关系，基于JNK1的靶向有望成为新的方案[9-6]o
微小核糖核酸(microRNA,miRNA-是一种长度约为03个碱基的小分子单链RNA，对机体的基因表达调控具有重要作用，广泛运用于恶性肿瘤的早期诊断和靶向。通过生物信息学预测，miR-33-5p与JNK1存在可能的靶向结合位点，因此，该研究拟通过人舌鳞癌细胞株CAL-27构建耐药细胞株，研究miR-33-0h靶向JNK1对耐药细胞的作用及其机制。
1材料与方法
131材料
1.1.7细胞培养人舌鳞癌细胞株CAL-27(中国科学院上海细胞库)，在5%CO/的37C环境温度下，培养于-%胎牛血清和1%青链霉素的DMEM 培养基中。
1.7.7主要试剂DMEM培养基、胎牛血清购自美国HycNue公司，卡铂(carUou”ku,CBP)、顺铂(cis-plPv,DDP)，紫杉醇(p v c/taxei,PTX)5-氟尿嘧啶(5-/uoroumci-,5-CU)购自齐鲁制药有限公司，TOzol 试剂、RIPA试剂、BCA试剂盒、MTT试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，Taymyu miRNA RT及universal master mix试剂盒购自美国Applied Biosystems公司，”pofectamiue2000试剂购自美国Theono Fisher公司，荧光素酶报告试剂盒购自美国Pomepa 公司,Rhl23试剂购自美国Sigma公司,miR-33-5p mimic及其inhibitor、scmmble inUibitor由上海吉玛制药技术有限公司合成，引物由北京擎科生物科技有限公司合成，实验所用一抗购自英国Abeam公司，二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
132方法
1.7.7细胞分组与处理方法将CAL-27细胞分为CAL-27组、CAL-27/LBP组、CAL-27/LBP+ scramble indibitof组、CAL-27/CBP+miR-C3-5p in-hibitof组o除CAL-27组细胞外，其余各组细胞通过
・229・安徽医科大学学报Ada Universitatii Medff t ie AnOrn202)Feb;56(1)
CBP诱导耐药细胞株，之后按照/pofectamina2200的操作说明，将作为阴性对照的scramble indibitor 转染进入CAL-67/TBP+scramble indibitor组细胞，将miN-33-Sp indibitor转染进入CAL-67/TBP+miN-33Bp inhibitor组细胞，转染45h后进行后续检测。
1.2.2耐药细胞株建立使用CBP诱导耐药细胞株，将CALB7细胞株培养于药物浓度2.9pg/mt的培养液中8d后更换正常培养液培养2d，当细胞生长成片时递增剂量，持续加药诱导5个月，当细胞能够在D p g/mi药物浓度下正常生长传代，即为耐 药细胞株CAL-67/TBP o
1.2.0耐药细胞形态鉴定取对数生长期的CAL-27、CALB7/CBP细胞接种于培养瓶中进行继续培养，待细胞贴壁后在显微镜下观察细胞形态并拍照。
1.2.0细胞生长曲线测定将对数生长期的细胞按1XD6个/孔接种于26孔板中，正常条件下进行培养，每隔24h对细胞计数一次，连续计数7d，以时间为横坐标，细胞数为纵坐标，制作生长曲线。
1.2.0MTT法检测细胞活力将贴壁生长的细胞制成单细胞悬液，接种于96孔板，每组3个复孔，正常条件下培养26h更换含对应浓度的化疗药物的培养基继续培养72h,MTT试剂盒检测577nm吸光度（A值），计算细胞活力。细胞活力=（实验孔A 值-空白孔A值）/（阴性对照孔A值-空白孔A 值）X102%。
1.2.0RT-PCR检测基因表达TUzol提取各组细胞总RNA，反转录试剂盒合成cDNA，通过universal mastar mix试剂盒提供的方法进行PCR反应，反应条件为：Stage1：95C D min,Stage2：95C D s,60 C60）,42个循环，结果采用2-AA Ct法进行计算。
1.2.0荧光素酶报告实验检测miN-33-Sp和JNK1靶向关系生物信息学网站Targetscan预测miR-33Bp和JNK1的靶向结合位点，构建JNK1pGL3luciferase pmmotar野生型（WT）和突变型（MUT）载体，分别和miN-33-Sp mimic和mimic NC共转染细胞，转染48h后检测荧光素酶活性。
1.2.0Western blot检测蛋白表达RIPA溶液抽提各组细胞总蛋白,BCA试剂盒定量，每孔32p g上样量上样，14%SDS-PAGE分离各组蛋白后转至PVDF膜上,5%脱脂牛奶封闭2h适量一抗6C孵育过夜，第2天加入适量二抗孵育2h滴加ECL显液进行曝光显影，凝胶成像仪下拍照并分析条带灰度进行相对定量。
1.2.0Rhl43聚集分析各组细胞制成220p t2
X D4个/mt的单细胞悬液，加入D p g/mt Rhl43于37C孵育32mix。清洗后正常培养基重悬37C 培养32min，清洗后重悬于加入了2pg/mt PI的PBS缓冲液中。流式细胞仪458nm激发光检测细胞Rhl43聚集，计数Rhl43阳性细胞数。
1.3统计学处理采用SPSS1&0统计软件处理实验数据，数据采用x±i的表示，两组间均数的比较采用t检验,P<
2.07为差异有统计学意义。
2结果
2.1CAL-27/CBP耐药细胞株的鉴定对耐药细胞进行形态鉴定，细胞株CALB7形态较为规则，细胞形态多呈圆形或椭圆形，大小均一；耐药细胞株CALB7/CBP细胞大小不一，细胞形态呈多角形，部分细胞体积增大，胞质丰富，见图1A；与CALB7细胞株比较,CALB7/CBP细胞株生长缓慢，差异有统计学意义（i=2.996,P=2.2221），见图1B。
A CAL-27CAL-27/CBP
时间（d）
图1CAL-2//CBP耐药细胞株鉴定
A：CALB7/CBP耐药细胞株形态鉴定;B:CALB7和CAL-27/ CBP细胞株生长曲线；与CALB7组比较：*P<7.05
2.2亲本细胞和耐药细胞对不同化疗药物的敏感性用浓度梯度递增的CBP持续作用于CALB7细胞建立了CALB7/CBP细胞株，使用多种化疗药物检测CALB7/CBP细胞株的多重耐药性，CALB7/ CBP耐药细胞株对化疗药物CBP、DDP、PTX和5-FU的敏感性均低于CALB7亲本细胞株，差异有统计学意义（CBP：1=2.972,P=2.0412；DDP:1
=
安徽医科大学学报 Ada Universitatii MednUitie Anhui 202) Feb ;56(7)
・229・
3. 177,P = 2. 033 8；PTX ：i =2. 972,P = 2. 061 1；7- FU ：1 =3.022,P=2. 032 9)，见图 2。2.3 miR-23-2p 与JNK1的靶向作用关系 通过 生物信息学数据库Targetscan 预测了 miR-33Bp 与 JNK1 3'端UTR 结构可能存在靶向作用关系，见图 3A o 与CALB7细胞株比较,CALB7/CBP 细胞株
miN-33-Sp 表达水平升高，差异有统计学意义(= 15. 97,P =2. 002 2)，见图3B 。荧光素酶报告实验
显示，与 JNK1 WT + mimico NC 比较,J NK1 WT +
miN-33-Sp 的荧光素酶活性下降，差异有统计学意
义(i = 4. 704, P = 2. 002 8)；而 JNK1 MUT + mimico NC 与JNK1 MUT + miN-33-Sp 比较无明显差异，见
图3C o
2.3 miR-23-2p 对JNK1/c-Jun 通路的抑制作用与CALB7组比较,CALB7/CBP 组细胞中miR-
33Bp 表达水平升高，差异有统计学意义(P <
2. 01)；与 CALB7/CBP 组 比较,CALB7/CBP + scrambia inhibitor 组细胞中miN-33-Sp 表达水平无
明显差异，CALB7/CBP + miN-33-Sp indibitor 组细 胞中miN-33-Sp 表达水平降低，差异有统计学意义
(P<2. 01) (F = 142.7, P =2. 002 2)，见图 4A 。与
CALB7 组比较,CALB7/CBP 组细胞中 JNK1、p-
JNK1、oNun 和p-c-Sun 蛋白水平均降低，差异有统
计学意义(P<2- 21)；与CALB7/CBP 组比较,CAL-
27/ C BP + scrambia indibitor 组细胞中 JNK1、p-
JNK1、oNun 和p-cNun 蛋白水平无明显差异，CAL- 27/ C BP + miN-33-Sp Nhibitor 组细胞中 JNK1、p-
JNK1、oNun 和p-c-Sun 蛋白水平升高，差异有统计
学意义(P<2. 21) (JNK1:F = 17. 82,P =2. 002 2；p-
JNK1:F = 96. 77,P =2.002 2；c-Sun :F = 18. 06,P = 2. 002 2；p BNnn ：F=33.09,P=2.002 2)，见图 4B 。
2.3 miR-23-2p 对CAL-27/CBP 细胞多重耐药性
的影响对各组细胞对不同化疗药物的ICs o 进行计
算，结果见表H 与CALB7组细胞比较，CALB7/
CBP 组细胞对不同化疗药物的IC 4均增加，差异有
统计学意义；与CALB7/CBP 组细胞比较，CALB7/
CBP + scrambia indibitor 组细胞对不同化疗药物的
ICs 2无明显差异,CAL-67/CBP + miN-33-5p inhibitor
组细胞对各化疗药物的IC 4均下降，差异有统计学
意义。
2.3 miR-23-2p 对多重耐药基因MDR1表达的影
响 CAL-67/CBP 组细胞Rhl23阳性百分比低于
0011
A
(*)a K g ®60402080
00
1
1
B 001
1
c 口 CAL-27
CBP 浓度(ng/mL)o
o o
o
O
8 6 4 2(％)z K g s DDP 浓度(pg/mL)
o
o o o o
8 6 4 2(*)-R K
g ®
□ CAL-27
D 100
o o O
6 4 2因 CAL-27/CBP ..
**
0.25 0.5 0.7525 50□ CAL-27
可 CAL-27/CBP
**
**
75
100
o 10
PTX 浓度(pg/mL)
5-FU 浓度Q ig/mL)
图/ MTT 检测CAL-27.CAL-27/CBP 细胞株对多种化疗药物的敏感性
A ：细胞对CBP 的敏感性；
B ：细胞对DDP 的敏感性；
C ：细胞对PTX 的敏感性;
D ：细胞对5-CU 的敏感性；与CALB7组比较：* P<7. 05,
* * P<7.
71
-230 •
安徽医科大学学报 Ada Universitatic Medicinali Anaul 202) Feb ；56(2)
A
...AUGAAUAAUACAUUUCAAUGCAA. . . 3'
I I I I I I I
ACGUUACGUUGAUGUUACGUG 5'
Position 954-961 of JNK1 3' UTR 5' hsa-miR-33-5p
31
pgl3图3 miN-33-3p 和JNK1的靶向作用关系
A ：Taryemcau 预测miRR3Rp 和JNK1靶向作用位点；
B ：RT-PCR 检测CALR5、CALR5/CBP 细胞中miRR3Rp 表达；
C ：荧光素酶报告实验
检测miRR3Rp 和JNK1靶向作用关系；与CALR5组或JNK1 WT + mimics NC 组比较：…P<0.61
8 6 4
2
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2 1 1 a o.
c 工
##
JNK1 p-JNKl P-actin
12 3 4
p-p-Jun p-JNKl c-Jun
c-Jun p ・c -Jun
图4 miN-33-3p 对JNK1/cJun 通路抑制作用
A ： RT-PCR 检测各组细胞miRR3Rp 表达；
B ： Western blot 检测各组细胞 JNKl/c-Cun 通路关键蛋白表达;
C ：JNK1/k-3un 通路关键蛋白相对表达水平;1 ：
CALR5 组；2 ： CALR5/CBP 组；3 ： CALR5/CBP + scramble inhibitoz 组；4 ： CALR5/
CBP + miRR3Rp itibitez 组；与 CALR5 组比较：…P<0. 61；与 CALR5/CBP 组比
较:##P<0.61
表1各组细胞多重耐药性比较(a=3,R g/mi )
组别
CBP DDP PTX 5-CU CALR510.84 ±1. O 9.39 ±0.84
0.43 ±0.0449.32 ±3.86CALR5/CBP
20.70 ±1.92 …
12.73 ±0 22 …0.92 ±0. O …
69.50 ±6.20 …CAL-27/CBP + scramble itibiRz 19.95 ±08712.82±O O
0.74 ±0. Il 70.32 ±5.94CAL-27/CBP + miR-83-5p itibiRz
12.70 ±1.32#
10.04 ±0.76#
0.82 ±0.05#
58 22 ±5.45#
值
20 0848.34323.62010.174
P 值
.
0
0.005 1
0.000,
0.002 ,
与 CALR5 组比较：…P<0. 01；与 CALR5/CBP 组比较：#P<0. 05
*
*3
4
工
CAL-27细胞，差异有统计学意义(P < 0. 0))；而 CAL-27/LBP + scramble inhibitof 组细胞相较于
CAL-27/LBP 组细胞RP123阳性百分比无明显差
异，CAL-27/LBP + miR-33-5p inhibitof 组细胞相较
于CAL-27/LBP 组细胞RP10阳性百分比升高，差异
有统计学意义(F = 332. 7 , P = 0. 000 0)，见图5A ° 与CAL-27组比较,CALR7/CBP 组细胞MDR)蛋白 水平升高，差异有统计学意义(P < 0. 0))；与CAL- 27/ L BP 组比较，CAL-27/LBP + scramble inhibitof 组
细胞MDR)蛋白水平无明显差异，CALR7/CBP +
miR-33-5p inhibitof 组细胞MDR)蛋白水平降低，差
异有统计学意义(F = 76. 0),P=0. 600 O )，见图5B
O
安徽医科大学学报Ada Universitativ MeOicinaliv Annui2021Fed;56(2)・237・
Rhl23
300 250 -200 150 100 50
150-
100-
MDR1200£
150二
100-
010101010
图6miR-S3-Sp对多重耐药基因MDR1的调控作用A：流式细胞术检测各组细胞Rhl25阳性百分比；B：WeWem blot 检测各组细胞MDR7蛋白表达；1:CA--67组；：CA-47/TBP组；：CA--67/TBP+scramble intibiter组；4：CA--27/TBP+miR-35-5p in-hibiter组；与CA--25组比较：…P<2.27；与CA--25/TBP组比较：##P<2.97药的方法成功建立了CAL-25/CBP耐药株，并检测了耐药株对CBP、DDP、PTX、5-LU等一系列化疗药物表现出耐药性，结果显示CAL-65/CBP耐药株拥有比亲本CAL-65细胞株更强的化疗药物耐受性。
JNK7是一种进化上保守的丝/苏氨酸蛋白激酶，属于促分裂原活化蛋白激酶(mitopex-activated protein
0x380,MAPK)家族的重要成员，因其可被诸如放射线、DNA损伤药物、活性氧及炎症细胞因子等多种环境应激因素激活，又被称为应激激活蛋白激酶[4]o通过磷酸化JNK7的酪氨酸和苏氨酸残基而使其发生激活，活化的JNK7可作用于转录因子cGuv的氨基末端使得cGuv磷酸化激活。转录因子c-Can作用于下游基因启动子的APG位点，调控这些基因的转录活性，而这一通路可诱导内源性凋亡相关通路的启动，进而引起细胞凋亡J1]o启动子区包含了APG位点的MDR7是JNK7/cGuv下游调控的基因之一，而MDR7基因的过度表达是肿瘤细胞多重耐药性的关键机制之一，临床化疗效果与MDR7表达密切相关,MDR7表达产物P糖蛋白具有将摄入细胞内的药物转运出细胞的能力，从而有效降低了化疗药物对肿瘤细胞的毒害作用[2]0研究表明JNK7/c-Cvv通路介导的MDR7上游APG位点激活对该基因表达起负调控作用[15-2]，在Choe U al的研究中，通过激活耐药细胞株的JNK7/c-J uv通路，MDR7的表达受到抑制，从而减少了MCF-5/ Dox细胞的多重耐药性[5]o本研究通过荧光素酶报告系统证实了miR-C3-6p和JNK7的靶向作用关系，进一步研究表明，在CAL-65/CBP耐药株中miR-C3-6p高表达，同时伴随着JNK7/c-J uv通路的失活，当通过miR-C3-6p indibitor抑制miR-C3-6p的表达后,JNK7/c-J uv通路恢复其活化状态。同时本研究观察到CAL-65/CBP耐药株的MDR7蛋白表达水平升高，并且其表达产物P糖蛋白对Rhl73的转运能力也得到提高，当miR-33-ap表达受到抑制时, CAL-65/CBP耐药株的多重耐药性减弱、MDR7蛋白表达水平下降、Rh23转运能力受到抑制，以上结果表明miR-C3-6p可升高CAL-65/CBP的多重耐药性。
3讨论
多重耐药性是指肿瘤细胞对一种化疗药物产生抗药性后，对化学结构和作用机制不同的其他多种化疗药物产生交叉耐药的现象[]0随着化疗药物应用的普及，肿瘤细胞的多重耐药性已逐渐成为化疗失败的重要原因，这一特性是多基因共同作用产生的复杂机制，其中，JNK1与这一过程有着重要联
系[42]o miR-C3-6p被发现在HPV阳性头颈部鳞状细胞癌中高表达，参与了肿瘤的发生发展过程J]o 通过生物信息学分析预测显示，miR-33-5p与JNK7可能存在靶向调控作用，而miR-33-5p和JNK7的靶向作用对口腔癌细胞多重耐药性的影响还缺乏研究报道。本研究首先通过小剂量逐步增加剂量持续给
综上所述，本研究证实了在CAL-65/CBP耐药株中，miR-C3-6p可靶向作用于JNK7，从而抑制JNK7的表达，抑制JNK7/c-Jvv通路的激活，进而引起MDR7蛋白表达升高,MDR7表达产物P糖蛋白加强了CAL-65/CBP耐药株的化疗药物转运出细胞的能力，从而提高了细胞的多重耐药性。本研究初
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