山姜属植物的抗肿瘤活性及其应用

1.本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及山姜属植物的抗肿瘤活性及其应用。

背景技术：

2.在全球十大高发的人类恶性肿瘤中，肺癌的发病率和死亡率增长最快，结直肠癌位居第三。肺癌的早期症状轻微，结肠癌的早期则缺乏典型症状，多数患者在诊断时往往已经进入中晚期，且可能发生转移。传统的手段如放化疗、靶向及免疫等存在着耐药、毒副作用高等问题，其预后也往往不尽如人意，寻毒副作用小的手段是所有癌症都急需解决的问题。目前应用于临床的抗肿瘤药物多数来源于天然产物及其衍生物，天然植物中的活性物质具有低毒、易吸收及活性高等优点，且具有抗氧化、抗病毒、调节免疫等生物学活性，可以作为传统癌症的辅助手段，具有广阔的开发前景。
3.肺癌和结肠癌的传统药物手段存在着耐药及高毒副作用的弊端，而天然植物活性物质是一种新型、低毒、易吸收的潜在药物，天然活性物质的调控作用相较于药物具有更高的安全性和可行性，即中药植物，尤其是药食同源植物，不仅可以应用于肿瘤，还可在肿瘤预防及辅助方面有更多的作为。因此，开发和研究出更多的、具有更好效果的天然植物及产物，对于抗肿瘤、预防肿瘤药物开发具有重要意义。我国芳香植物种类繁多，资源广泛，目前的开发利用主要集中在美化和香化作用。然而现代科学研究发现，芳香植物种富含挥发油、生物碱、黄酮、多糖等活性物质，这些成分在抗菌、消炎、抗病毒及抗氧化等方面均发挥着重要作用。研究其活性物质的抗肿瘤活性，对预防和疾病大有裨益。目前能够用于抗肿瘤药物的天然植物还较少。
4.山姜属植物是广泛分布于我国南方各地区的多年生草本芳香族植物，该类植物多数为药食同源，其中益智是我国资源丰富的芳香族植物，广泛分布于亚洲热带地区，而桂草寇则主要分布在广西自治区。益智作为药用植物具有悠长的历史，常被用作中医常用药材，用于脾寒泻泄、腹痛、食欲不振、肾虚遗尿等症状，多年来这种植物受到植物化学界及药理学界的关注。有研究显示，益智仁提取物对肝癌细胞具有很好抑制作用(张乔.益智仁提取物促肝癌细胞凋亡及抗大鼠化学性肝损伤的活性及机制研究[d].沈阳药科大学,2016.doi:10.27330/dki.gsyyu.2016.000029.)，但对其他的肿瘤是否有作用还未知。而关于桂草寇的药用研究较少，目前较多的研究是其所含精油成分表现出广谱的抗菌活性，对于其是否具有抗肿瘤活性也未知。

技术实现要素：

[0005]
本发明要解决的技术问题是克服上述问题的缺陷和不足，提供山姜属植物，主要是益智和桂草寇的抗肿瘤活性及其应用。
[0006]
本发明的目的是提供山姜属植物在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0007]
本发明的另一目的是提供一种包含山姜属植物的抗肿瘤药物。
[0008]
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
[0009]
本发明采用的益智(拉丁学名：alpinia oxyphylla miq.)，别名：益智仁、益智子。姜科，山姜属多年生草本植物。株高可达3米；茎丛生；根茎短，叶片披针形。有特异香气，味辛、微苦。果实供药用，有益脾胃，理元气，补肾虚滑沥的功用。治脾胃(或肾)虚寒所致的泄泻，腹痛，呕吐，食欲不振，唾液分泌增多，遗尿，小便频数等症。资料来源：益智(姜科植物)_百度百科https://bai ke.baidu/item/％e7％9b％8a％e6％99％ba/60334？fr＝aladdin。
[0010]
桂草蔻(拉丁学名：alpinia guilinensis)姜科，山姜属多年生草本植物，主要分布在广西自治区，其精油成分表现出广谱的抗菌活性。资料来源：桂草蔻alpinia guilinensis|iplant植物智——植物物种信息系统http://www.iplant/info/alpinia％20guilinensis。
[0011]
本发明通过研究显示，益智和桂草寇均能有效抑制肺癌a549细胞和结肠癌sw480细胞的增殖，对肺癌和结肠癌均具有肿瘤杀伤作用，并且能促进肺癌和结肠癌细胞凋亡；同时发现，益智和桂草寇对a549细胞周期的影响主要是将细胞阻滞在g2/m期，细胞周期表现为药物处理后g2/m期比例升高，g1期比例下降，对sw480细胞周期的影响主要则是将细胞周期阻滞在g1/s期，表现为g1期比例升高，s期比例下降；以上研究发现为芳香植物资源的开发利用及肿瘤的提供了新的方法和思路。
[0012]
因此，本发明要求保护如下应用方案：
[0013]
山姜属植物在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0014]
山姜属植物在制备辅助肿瘤药物中的应用。
[0015]
进一步地，所述药物为抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡和/或促进肿瘤细胞周期停滞的药物。
[0016]
山姜属植物在制备抑制肿瘤细胞增殖药物中的应用。
[0017]
山姜属植物在制备促进肿瘤细胞凋亡药物中的应用。
[0018]
山姜属植物在制备促进肿瘤细胞周期停滞药物中的应用。
[0019]
具体优选地，所述山姜属植物为益智和/或桂草寇。
[0020]
进一步地，所述肿瘤为肺癌和/或结肠癌。
[0021]
更优选地，所述肺癌为肺癌a549细胞系。
[0022]
更优选地，所述结肠癌为结肠癌sw480细胞系。
[0023]
本发明还提供一种肺癌和/或结肠癌的药物，其包括山姜属植物。
[0024]
优选地，所述山姜属植物为益智和/或桂草寇。
[0025]
优选地，益智和桂草寇的用药部位为枝和/或叶。
[0026]
另外，将山姜属植物益智和桂草寇开发为药物的具体方案，可参考采用中药常规提取方法，比如水提、醇提等。本发明如下实施例中给出了一种可供选择的醇提方案，即乙醇提取物。
[0027]
作为一种可供选择的具体提取方案，将益智和/或桂草寇枝叶用50％-80％乙醇浸提。优选地，采用70％乙醇浸提。
[0028]
优选地，料液比为1:(5-15)。最优选地料液比为1:10。
[0029]
优选地，在40℃-50℃加热浸提。优选地浸提时间为2-6h。最优选45℃加热浸提4h。
[0030]
优选地，浸提2-4次。最优选浸提3次。
[0031]
另外，优选地，枝叶干燥后粉碎，过50-80目筛(优选60目筛)后，进行浸提。
[0032]
优选地，所述干燥可采用风干。
[0033]
最后，作为一种最优选地的可供选择的具体提取方案，方法如下：将益智和/或桂草寇枝叶风干后粉碎，过60目筛网；然后用70％乙醇以料液比1:10，45℃加热浸提4h，浸提3次。浸提液使用医用纱布过滤得滤液，滤液减压浓缩得总浸膏，加蒸馏水制成悬浮液，即得。
[0034]
本发明具有以下有益效果：
[0035]
本发明提供山姜属植物益智和桂草寇的抗肿瘤活性及其应用，研究表明益智和桂草寇能显著抑制肺癌细胞和结肠癌细胞增殖，对肺癌和结肠癌均具有肿瘤杀伤作用，并且能促进肺癌和结肠癌细胞凋亡；同时发现，益智和桂草寇对肺癌细胞周期的影响主要是将细胞阻滞在g2/m期，细胞周期表现为药物处理后g2/m期比例升高，g1期比例下降，对结肠癌细胞周期的影响主要则是将细胞周期阻滞在g1/s期，表现为g1期比例升高，s期比例下降。因此，山姜属植物益智和桂草寇具有很好的抗肿瘤活性，为抗肿瘤提供一种新的低毒、易吸收的天然药物选择，避免肺癌和结肠癌的传统药物手段存在的耐药及高毒副作用，从而提升益智和桂草寇的资源应用以及为肺癌和结肠癌的提供一种新的方向。
[0036]
而且，益智和桂草寇是具有香料价值和药用价值二者兼有的芳香植物体，其资源广泛，且为药食同源植物，因此，成本也低，本发明利用这些天然植物的其他药用部位，开发更多方面的应用，还能在肿瘤预防及辅助方面有更多的作为。
附图说明
[0037]
图1为益智和桂草寇抑制a549和sw480细胞增殖图；
[0038]
图2为益智和桂草寇诱导a549细胞凋亡图；
[0039]
图3为益智和桂草寇诱导sw480细胞凋亡图；
[0040]
图4为益智和桂草寇促使a549细胞周期停滞图；
[0041]
图5为益智和桂草寇促使sw480细胞周期停滞图。
具体实施方式
[0042]
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0043]
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0044]
本发明使用的材料：肺癌a549细胞系和结肠癌sw480细胞系来源于atcc细胞库。
[0045]
本发明使用的试剂：乙醇(广州牌，gs0395ar)，石油醚(aladdin，p116176)，乙酸乙酯(macklin，e809174)，dmso(mp，0219605580)，胎牛血清(sigma，1107)，dulbecco's modified eagle medium(corning，10-017-cvr)和roswell park memorial institute-1640(corning，10-040-cvr)，cell counting kit-8(apexbio，k1018)。
[0046]
本发明使用的试剂盒：凋亡试剂盒(碧云天，c1062m)，细胞周期检测试剂盒(碧云天，c1052)。
[0047]
本发明的统计分析方法：以下实施例中所得数据均采用spss 21.0进行单因素方
差分析，实验结果采用平均值
±
标准误表示，并采用graphpad prism 6软件进行绘图。其中，p＜0.05即为统计学有显著差异，p＜0.05标记为*；p＜0.01标记为**；p＜0.001标记为***。
[0048]
以下实施例中所用药物，以益智和桂草寇的醇提物为例。具体地，所述益智和桂草寇的醇提物制备方法为：益智枝叶风干后粉碎，过60目筛网备用。用70％乙醇以料液比1:10，45℃加热浸提4h，浸提3次。浸提液采用医用纱布过滤得滤液，滤液减压浓缩得总浸膏，加蒸馏水制成悬浮液待用。采用同样方法制备桂草寇有机提取物。
[0049]
实施例1益智和桂草寇抑制肿瘤细胞的增殖
[0050]
每孔分别接种3000个a549和sw480细胞至96孔板中，加入相应的培养基(sw480细胞使用dmem培养基，a549细胞使用1640培养基)于37℃培养箱中培养24-48h，细胞贴壁24-48h后，更换培养液，并加入62.5、125、250、500、1000μg/ml浓度梯度的益智和桂草寇(溶剂为dmso，并以dmso处理作为溶剂对照)。培养48h，更换培养基，每孔加入100μl含10％cck8溶液的新鲜培养基，37℃继续培养2-4小时，用酶标仪在450nm处检测吸光值，每组3个重复，使用cell counting kit-8检测细胞增殖情况，肿瘤细胞存活率(cell viability％)＝实验组吸光度平均值/对照组吸光度平均值
×
100％，并计算其ic50。
[0051]
结果如图1所示，显示益智和桂草寇能够有效抑制肿瘤细胞a549和sw480的增殖，a549和sw480的细胞存活率均随着益智和桂草寇浓度增加而降低，其中，益智对a549细胞的ic50为138.0μg/ml，对sw480细胞的ic50为108.3μg/ml，桂草寇对a549细胞的ic50为87.85μg/ml，对sw480细胞的ic50为104.5μg/ml。提示在肺癌和结肠癌中益智和桂草寇均具有肿瘤杀伤作用。
[0052]
实施例2益智和桂草寇诱导肿瘤细胞的凋亡
[0053]
将细胞通过细胞计数以每孔1
×
105个a549肿瘤细胞的密度接种至12孔板中，培养箱中培养24-48h，细胞贴壁24-48h后，更换新的培养液，根据各药物的ic50加入相应的浓度处理48h，加入浓度为138.0μg/ml的益智和87.9μg/ml的桂草寇处理。取上清至离15ml离心管中，胰酶消化收集细胞至原液中，1000g离心5min，收集细胞并用预冷的pbs清洗2遍。细胞重悬后，采用细胞周期检测试剂盒对细胞进行染，每组3个重复，并以dmso处理作为溶剂对照。按照凋亡试剂盒说明书进行annexin v-pi染，1h内使用流式细胞仪进行检测。肿瘤细胞凋亡率(apoptosis％)＝早期凋亡％(annexin v+pi-)+晚期凋亡％(annexin v+pi+)。
[0054]
同样地，我们分别使用浓度为108.3μg/ml的益智和104.5μg/ml的桂草寇处理sw480细胞，其方法步骤同上。
[0055]
结果如图2所示，流式细胞仪检测分析结果显示，添加ic50浓度的益智和桂草寇能显著诱导a549细胞发生凋亡。采用益智和桂草寇处理sw480细胞后结果如图3所示，发现与对照组相比，益智和桂草寇处理的sw480细胞的凋亡率显著高于对照组。即益智和桂草寇均能诱导肿瘤细胞a549和sw480发生凋亡。
[0056]
实施例3益智和桂草寇促使肿瘤细胞周期停滞
[0057]
分别将细胞通过细胞计数以每孔1
×
105个a549和sw480细胞接种至12孔板中，细胞贴壁24-48h后，更换新的培养液，根据各药物的ic50加入相应浓度的益智和桂草寇处理48h。胰酶消化细胞并轻轻吹散，离心沉淀细胞，加入1ml预冷的pbs重悬后再沉淀。后加入1ml预冷的70％乙醇固定过夜，经沉淀和清洗后，除乙醇，使用细胞周期检测试剂盒染，并
以dmso处理作为溶剂对照，并使用流式细胞仪在488nm波长处检测红荧光，并检测光散射情况，最后使用modfit软件进行拟合。
[0058]
结果如图4所示，发现益智和桂草寇对a549细胞周期的影响主要是将细胞阻滞在g2/m期，细胞周期表现为药物处理后g2/m期比例升高，g1期比例下降；如图5所示，对sw480细胞周期的影响主要则是将细胞周期阻滞在g1/s期，表现为g1期比例升高，s期比例下降，促使细胞周期阻滞在g1/s期。
[0059]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.山姜属植物在制备抗肿瘤药物中的应用。2.山姜属植物在制备辅助肿瘤药物中的应用。3.山姜属植物在制备抑制肿瘤细胞增殖药物中的应用。4.山姜属植物在制备促进肿瘤细胞凋亡药物中的应用。5.山姜属植物在制备促进肿瘤细胞周期停滞药物中的应用。6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物为抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡和/或促进肿瘤细胞周期停滞的药物。7.根据权利要求1～5任一所述应用，其特征在于，所述山姜属植物为益智和/或桂草寇。8.根据权利要求1～5任一所述应用，其特征在于，所述肿瘤为肺癌和/或结肠癌。9.一种肺癌和/或结肠癌的药物，其特征在于，包括山姜属植物。10.根据权利要求9所述药物，其特征在于，所述山姜属植物为益智和/或桂草寇。

技术总结

本发明公开了山姜属植物的抗肿瘤活性及其应用。本发明研究显示，益智和桂草寇能显著抑制肺癌细胞和结肠癌细胞增殖，对肺癌和结肠癌均具有肿瘤杀伤作用，并且能促进2种癌细胞凋亡；同时，益智和桂草寇对肺癌细胞周期的影响主要是将细胞阻滞在G2/M期，细胞周期表现为药物处理后G2/M期比例升高，G1期比例下降，对结肠癌细胞周期的影响主要则是将细胞周期阻滞在G1/S期，表现为G1期比例升高，S期比例下降；结果表明，益智和桂草寇具有很好的抗肿瘤活性，为抗肿瘤提供了一种新的低毒、易吸收的天然植物来源的药物选择，避免传统抗肿瘤药物存在的耐药及高毒副作用等弊端，也为山姜属资源的进一步开发和利用提供了新的途径。源的进一步开发和利用提供了新的途径。源的进一步开发和利用提供了新的途径。