一种水相自发荧光叶酸载体的制备方法

1.本发明涉及功能材料和生物材料技术领域，尤其涉及一种水相自发荧光叶酸载体的制备方法。

背景技术：

2.癌症疾病是由细胞的突变积累引起，其发生过程漫长，并受遗传突变、环境和生活方式等多种因素影响，已是人类健康的主要威胁。虽然针对癌症的诊断程序和手段都取得了快速的进展，但癌症的总体生存率并没有很大程度的提高。目前，癌症的手段包括手术、放疗和化疗，近年来还兴起光学疗法。而化疗仍是简单有效以及最具普适性的方法。其原理是利用化学物质干扰癌细胞的分裂和增殖动力学过程，阻止癌细胞的生长，或直接杀死癌细胞，从而达到目的。
3.因此，多种抗肿瘤药物被广泛用于癌症，然而，它们的毒副作用是临床应用的主要障碍。如食欲不振、严重腹泻、呕吐、脱发等，对患者的生存质量造成了严重的影响，限制了化疗在临床实践中的应用。因此，如何规避化疗药物带来的系统毒性并实现癌症的高效是目前的重点研究方向。为了克服这个弊端，使用新型的前药载体，特异性地靶向肿瘤细胞从而实现癌症的精准诊断与，实现抗肿瘤药物的精准递送，来降低传统抗癌药物的毒副作用是一种很有前景的策略。与传统的方式相比，使用纳米载体传递药物具有很多优势：(1)纳米载体可通过包埋或键合的方式负载药物提升其溶解能力；(2)纳米载体可保证到达病灶部位的药物的生物活性，避免生物不稳定的药物(如核酸、蛋白质)在体内循环时受到ph的破坏或酶的降解；(3)纳米载体可将药物直接递送至靶区，降低药物在非期望靶区的积累，从而降低系统毒性；(4)纳米载体可通过响应肿瘤部位的微环境控制药物定时、定点释放，减少药物在循环过程中的渗漏，从而达到更优的抗肿瘤活性与更低的系统毒性。
4.目前，常用的载体分为无机载体和有机载体两大类。无机载体包括金属氧化物(超顺磁氧化铁、氧化镍纳米颗粒)、金属载体(金纳米颗粒)、介孔二氧化硅和碳基纳米载体(单壁碳纳米管、石墨烯氧化物)等。有机载体包括脂质体、聚合物、树枝状大分子、无机纳米颗粒、团聚体、蛋白质和分子靶向纳米粒子等。有机载体相较于无机载体具有很多优点，如生物相容性好、可修饰程度高、对所载药物有广泛的适应性、生物利用度高、低免疫原性以及毒副作用小等优点。
5.然而，现有载体存在低生物相容性、药物载荷低以及缺乏主动靶向及示踪的缺点。

技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种水相自发荧光叶酸载体的制备方法，所制备的水相自发荧光叶酸载体具有良好的生物相容性和更高的药物有效载荷，更有选择性地靶向到肿瘤内部进行荧光示踪成像，实现精准的多功能药物递送载体。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
8.本发明提供了一种水相自发荧光叶酸载体的制备方法，包括以下步骤：
9.将叶酸、au
22
(sg)
18
纳米粒子溶液、n-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和缓冲溶液混合，进行脱水缩合反应，得到水相自发荧光叶酸载体。
10.优选的，所述叶酸、au
22
(sg)
18
纳米粒子溶液中au
22
(sg)
18
纳米粒子、n-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的摩尔比为(0.1～0.2):(0.8～1):(0.15～0.2):(0.15～0.2)。
11.优选的，所述缓冲溶液为pbs缓冲溶液，所述pbs缓冲溶液的ph值为5.5～6.5，浓度为90～110mmol/l。
12.优选的，所述pbs缓冲溶液与au
22
(sg)
18
纳米粒子溶液的体积比为4:1。
13.优选的，所述脱水缩合反应的温度为室温，时间为24～36h。
14.本发明提供了上述技术方案所述制备方法制备得到的水相自发荧光叶酸载体，包括金-谷胱甘肽纳米复合粒子和接枝于所述金-谷胱甘肽纳米复合粒子表面的叶酸基团。
15.本发明提供了上述技术方案所述水相自发荧光叶酸载体在药物转运及示踪领域中的应用。
16.本发明利用叶酸分子表面的羧基与1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺反应生成不稳定的o-酰基脲；同时加入n-羟基琥珀酰亚胺减少水解的发生，生成具有氨基反应活性的活泼酯；然后与au
22
(sg)
18
纳米粒子的氨基官能团，进行脱水缩合反应，得到叶酸载体。该叶酸载体是以共价键接枝到纳米粒子表面，具有简便易得、稳定、尺寸小和生物相容性好等优点，尤其是自发荧光的特性，为药物的转运及示踪提供良好的平台。而且载体表面富含谷胱甘肽基团和叶酸基团，毒副作用相对较小，可修饰性强，具有高效药物负载能力，更有选择性地靶向到肿瘤内部，为实现载药的精准输送，癌细胞的靶向提供参考。
17.本发明制备的自发荧光叶酸载体中，谷胱甘肽和叶酸基团表面含有丰富的氨基和羧基等基团，便于进行再修饰，再负载不同的功能分子，因而具有高效药物负载功能；此外，叶酸基团有利于实现纳米粒子与癌细胞的细胞膜相互作用，便于被癌细胞内吞，更有选择性地靶向到肿瘤内部，实现载药的精准输送，癌细胞的靶向。
18.本发明制备的自发荧光叶酸载体具备尺寸小、生物相容性好和毒副作用小等优点，在生物体转运过程中有效降低各种不良反应：本发明利用au
22
(sg)
18
纳米粒子(金-谷胱甘肽纳米复合粒子)的氨基官能团与叶酸的羧基进行羧氨反应，将叶酸共价键接枝于au
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(sg)
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纳米粒子上，得到的叶酸载体稳定、尺寸小，生物相容性好；而且载体表面为谷胱甘肽链接的叶酸基团，毒副作用相对较小。
19.本发明制备的叶酸载体由于含有多功能au
22
(sg)
18
纳米粒子，具有自发荧光的特性，能够避免在、放疗和化疗过程中，难于进行荧光示踪成像的难题，免去传统的靶向药物需要进行荧光标记的复杂繁琐过程，减少合成路径，降低毒性。
20.本发明制备的叶酸载体具有癌细胞主动靶向功能，这是由于叶酸与叶酸受体之间具有很强的结合力，能通过配体-受体结合作用被高效介导进入肿瘤细胞，可以有效改善和提高传统抗癌药物的靶向能力，为用药少、效果好提供了可能性。
21.本发明制备的叶酸载体通过叶酸和谷胱甘肽之间形成稳定的酰胺键，具备优异的稳定性，而且叶酸及谷胱甘肽基团还可以进行再修饰，具有很大的多功能修饰性，为负载不同功能的药物及可靠稳定性提供了良好的平台。
附图说明
22.图1为实施例1制备的叶酸载体的透射电子显微镜照片；
23.图2为实施例1制备的叶酸载体的粒径分布柱状图；
24.图3为实施例2制备的叶酸载体的粒径分布柱状图；
25.图4为实施例1制备的叶酸载体被mda细胞内吞的显微镜照片；
26.图5为实施例2制备的叶酸载体被mda细胞内吞的显微镜照片。
具体实施方式
27.本发明提供了一种水相自发荧光叶酸载体的制备方法，包括以下步骤：
28.将叶酸、au
22
(sg)
18
纳米粒子溶液、n-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和缓冲溶液混合，进行脱水缩合反应，得到水相自发荧光叶酸载体。
29.在本发明中，若无特殊说明，所需制备原料均为本领域技术人员熟知的市售商品。
30.在本发明中，所述au
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(sg)
18
纳米粒子溶液的浓度优选为12.5mmol/l。
31.在本发明中，所述au
22
(sg)
18
纳米粒子溶液的制备方法优选包括：将氯金酸溶液、谷胱甘肽(gsh)溶液和氢氧化钠溶液混合，进行第一反应，得到第一产物；向所述第一产物中通入co气体，进行第二反应，得到第二产物；将所述第二产物与盐酸溶液混合，进行第三反应，得到au
22
(sg)
18
纳米粒子溶液。
32.在本发明中，所述氯金酸溶液的浓度优选为20～30mmol/l，更优选为25mmol/l；所述谷胱甘肽溶液的浓度优选为50～60mmol/l；所述氢氧化钠溶液的浓度优选为1～2mol/l；所述氯金酸溶液中氯金酸和谷胱甘肽溶液中谷胱甘肽的摩尔比优选为1:1.5；所述氯金酸溶液、谷胱甘肽溶液和氢氧化钠溶液的体积比优选为12.5:7.5:1；所述氯金酸溶液、谷胱甘肽(gsh)溶液和氢氧化钠溶液所用溶剂均优选为水。在本发明中，所述氯金酸溶液、谷胱甘肽(gsh)溶液和氢氧化钠溶液混合的过程优选为向氯金酸溶液中加入谷胱甘肽(gsh)溶液，再加入naoh溶液。本发明使用氢氧化钠溶液调节混合溶液的ph值为10～11。
33.在本发明中，所述第一反应的ph值优选为10～11，温度优选为室温，即不进行额外的升温或降温，时间优选为0.5～1h；所述第一反应优选在密封+搅拌条件下进行；本发明对所述搅拌的速率没有特殊的限定，按照本领域熟知的过程保证反应顺利进行即可。
34.在本发明中，向所述第一产物中通入co气体的时间优选为5min；本发明对所述通入co气体的速率没有特殊的限定，按照本领域熟知的过程进行即可；所述第二反应的时间优选为1～2h；所述第二反应优选在搅拌条件下进行；本发明对所述搅拌的速率没有特殊的限定，按照本领域熟知的过程保证反应顺利进行即可。
35.在本发明中，所述盐酸溶液的浓度优选为1mol/l；所述盐酸溶液所用溶剂优选为水；本发明使用盐酸溶液调节第二产物的ph值为2.5～3；所述第三反应的ph值优选为2.5～3，时间优选为24～36h；所述第三反应优选在密闭条件下进行。本发明对所述第二产物与盐酸溶液混合的过程没有特殊的限定，按照本领域熟知的过程进行即可。
36.在本发明中，所述叶酸、au
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(sg)
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纳米粒子溶液中au
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(sg)
18
纳米粒子、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(edc)的摩尔比优选为(0.1～0.2):(0.8～1):(0.15～0.2):(0.15～0.2)，更优选为0.15:1:0.15:0.15。本发明利用nhs和edc活化羧基，催化羧氨反应，便于叶酸接枝于au
22
(sg)
18
纳米粒子上。
37.在本发明中，所述缓冲溶液优选为pbs缓冲溶液，所述pbs缓冲溶液的ph值优选为5.5～6.5，浓度优选为90～110mmol/l，所述pbs缓冲溶液与au
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(sg)
18
纳米粒子溶液的体积比优选为4:1。
38.在本发明中，所述叶酸、au
22
(sg)
18
纳米粒子溶液、n-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和缓冲溶液混合的过程优选为在缓冲溶液中加入au
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(sg)
18
纳米粒子溶液，加入n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(edc)，再加入叶酸。
39.在本发明中，所述脱水缩合反应的温度优选为室温，即不进行额外的升温或降温；时间优选为24～36h，更优选为28～32h；所述接枝反应优选在搅拌条件下进行；本发明对所述搅拌的速率没有特殊的限定，保证反应顺利进行即可。
40.在所述接枝反应过程中，au
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(sg)
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纳米粒子含有的氨基官能团与叶酸的羧基结合，进行羧氨反应，将叶酸基团共价接枝于au
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(sg)
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纳米粒子表面。
41.完成所述接枝反应后，本发明优选将所得产物干燥，得到自发荧光叶酸载体。本发明对所述干燥的过程没有特殊的限定，按照本领域熟知的方法干燥即可。在本发明的实施例中，完成所述接枝反应后，不进行干燥，直接将所得自发荧光叶酸载体溶液用于后续试验。
42.本发明提供了上述技术方案所述制备方法制备得到的水相自发荧光叶酸载体，包括金-谷胱甘肽纳米复合粒子和接枝于所述金-谷胱甘肽纳米复合粒子上的叶酸。
43.本发明提供了上述技术方案所述水相自发荧光叶酸载体在制备药物递送系统中的应用。本发明对所述应用的方法没有特殊的限定，按照本领域熟知的方法应用即可。
44.下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
45.实施例1
46.取12.5ml 20mmol/l氯金酸溶液，置于圆底烧瓶中，加入7.5ml 50mmol/l谷胱甘肽(gsh)溶液，再加入1ml 1mol/lnaoh溶液调至溶液ph值为11，室温下密封搅拌反应0.5h，然后通入co气体5min，继续搅拌反应1h，再加入1ml 1mol/l hcl溶液调至溶液ph为2.5，然后密闭反应24h，得到au
22
(sg)
18
纳米粒子溶液(12.5mmol/l)；
47.在320ml pbs(ph 6.2,100mmol/l)缓冲溶液中，加入80ml所述au
22
(sg)
18
纳米粒子溶液，得到au
22
(sg)
18
纳米粒子摩尔量为1mmol，置于锥形瓶中，加入n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)0.15mmol和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(edc)0.15mmol，再加入叶酸(fa)0.15mmol，室温下继续搅拌反应24h，得到au
22
(sg)
18
纳米粒子叶酸载体溶液。
48.实施例2
49.取12.5ml 20mmol/l氯金酸溶液，置于圆底烧瓶中，加入7.5ml 50mmol/l谷胱甘肽(gsh)溶液，再加入1ml 1mol/lnaoh溶液调至溶液ph值为11，室温下密封搅拌反应0.5h，然后通入co气体5min，继续搅拌反应1h，再加入1ml 1mol/l hcl溶液调至溶液ph为2.5，然后密闭反应24h，得到au
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(sg)
18
纳米粒子溶液；
50.在320ml pbs(ph 6.2,100mmol/l)缓冲溶液中，加入80ml所述au
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(sg)
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纳米粒子
溶液，置于锥形瓶中，随后加入n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)0.15mmol和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(edc)0.15mmol，再加入叶酸(fa)(0.1mmol)，室温下继续搅拌反应24h，得到au
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(sg)
18
纳米粒子叶酸载体溶液。
51.表征
52.1)图1为实施例1制备的叶酸载体的透射电子显微镜照片；由图1可知，实施例1制备的叶酸载体颗粒呈椭球形，且颗粒自尺寸分布较为均匀。
53.图2为实施例1制备的叶酸载体的粒径分布柱状图；由图2可知，实施例1制备的叶酸载体的平均粒径为2.7nm。
54.2)图3为实施例2制备的叶酸载体的粒径分布柱状图；由图3可知，实施例2制备的叶酸载体的平均粒径为1.9nm。
55.测试例
56.将mda-mb-231人乳腺癌细胞(htb-26，)在含有10％fbs、1％l-谷氨酰胺和0.1％抗生素(青霉素/链霉素)的培养基进行培养，再滴加入1ml不同实施例制备的叶酸载体溶液进行共培养；培养24h后进行荧光显微镜成像，所得结果见图4～5。
57.图4为实施例1制备的叶酸载体被mda细胞内吞的显微镜照片；图5为实施例2制备的叶酸载体被mda细胞内吞的显微镜照片。由图4～5可知，实施例1～2分别采用不同负载量叶酸得到不同尺寸的粒子，说明不同尺寸的叶酸载体都可以被癌细胞内吞；而且，说明在溶液情况下该载体可保持稳定的结构，不被外界的环境所影响，这是由于金/谷胱甘肽/叶酸分子都是共价偶联反应。
58.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：

1.一种水相自发荧光叶酸载体的制备方法，包括以下步骤：将叶酸、au
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(sg)
18
纳米粒子溶液、n-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和缓冲溶液混合，进行脱水缩合反应，得到水相自发荧光叶酸载体。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述叶酸、au
22
(sg)
18
纳米粒子溶液中au
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(sg)
18
纳米粒子、n-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的摩尔比为(0.1～0.2):(0.8～1):(0.15～0.2):(0.15～0.2)。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲溶液为pbs缓冲溶液，所述pbs缓冲溶液的ph值为5.5～6.5，浓度为90～110mmol/l。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述pbs缓冲溶液与au
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纳米粒子溶液的体积比为4:1。5.根据权利要求1～4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述脱水缩合反应的温度为室温，时间为24～36h。6.权利要求1～6任一项所述制备方法制备得到的水相自发荧光叶酸载体，其特征在于，包括金-谷胱甘肽纳米复合粒子和接枝于所述金-谷胱甘肽纳米复合粒子表面的叶酸基团。7.权利要求7所述水相自发荧光叶酸载体在药物转运及示踪领域中的应用。

技术总结

本发明提供了一种水相自发荧光叶酸载体的制备方法，属于功能材料和生物材料技术领域。本发明利用叶酸分子表面的羧基与1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺反应生成不稳定的O-酰基脲；同时加入N-羟基琥珀酰亚胺减少水解的发生，生成具有氨基反应活性的活泼酯；然后与Au

技术研发人员：

吴爽 周佩 于书淳 王莉 王继萍 李仁杰

受保护的技术使用者：

华北水利水电大学

技术研发日：

2022.07.25

技术公布日：

2022/11/18