一种国家二级保护植物丰都车前组培快繁的方法与流程

1.本发明属于珍稀植物保护技术领域，涉及一种国家二级保护植物丰都车前组培快繁的方法。

背景技术：

2.丰都车前(plantago fengdouensis)，车前科车前属多年生草本植物，是2001年4月在三峡库区重庆市丰都县城东长江江心沙滩上发现的车前属一新分类，2004年将其提升为一个独立的种，为三峡库区特有植物。三峡工程兴建后海拔175m以下丰都车前的原产地被淹没，另受移民活动等人为影响，其生存环境受到严重威胁，现为国家二级保护野生植物。
3.丰都车前野生植株叶基生呈莲座状，叶片具3脉，披针形至线状披针形，叶缘羽状锐裂，长为宽的2.5倍以上，无毛，或在裂片弯缺处具短毛；花冠淡黄、红粉，裂片狭三角形；花药红黄；蒴果纺锤状椭圆形。丰都车前分布区狭窄，只分布在丰都、忠县、巴南区和江津区四个彼此隔离的长江江心岛上，是三峡库区消落带特有的草本植物。丰都车前可忍耐随长江水位的涨落周期性的水淹和出露，全年水淹时间30天左右而不影响存活，可以作为一种很好的试验材料来研究该植物对特殊环境生态适应性和应对机制，且车前属植物具有很高的医用价值。因此，对丰都车前进行繁育试验研究具有重要意义。
4.目前对丰都车前的研究主要集中在分类、迁地保护、生物学特性观测等方面，而关于其繁育方面的研究，尤其是组培快繁的研究，国内外尚未见报道。佟少明等人(2013)对平车前直接分化不定芽的研究发现，6-ba能促进平车前根颈直接分化生长芽，但对叶片、叶柄直接分化生长芽无促进作用；王勇等人(2006)发现丰都车前果期长、种子产量少、发芽率低，可能是其狭域分布和数量稀少的一个原因，然而不清楚导致其繁殖障碍的生物学和生态学原因，以及如何解除这种障碍。因此，建立丰都车前组培快繁体系非常必要。

技术实现要素：

5.本发明公开了一种国家二级保护植物丰都车前组培快繁的方法，以当年生丰都车前幼嫩叶片、叶柄和根为外植体，通过外植体消毒、诱导外植体直接产生不定芽、不定芽生根、组培苗移栽等一系列步骤，获得繁殖系数高、遗传稳定的组培苗，不经过愈伤组织诱导过程，减少了工作量和能源消耗，操作简便，经济有效，实用性好，填补了丰都车前在组培快繁的研究空白，能够为丰都车前的快速繁殖、物种的保护、新品种的培育等提供技术支持。
6.为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
7.一种国家二级保护植物丰都车前组培快繁的方法，包括以下步骤：
8.s1：采集当年生丰都车前幼嫩的叶片、叶柄和根组织，用自来水冲去外植体上的灰尘，将外植体灭菌；使用无菌手术刀切成段或块；
9.s2：接种在不定芽诱导培养基上，叶片、叶柄和根组织三种外植体诱导出不定芽；
10.s3：将诱导出的不定芽接种于生根培养基上；
11.s4：挑选生长健壮的组培苗移栽到基质中，完成国家二级保护植物丰都车前组培快繁。
12.优选地，所述步骤s1中，外植体用0.05-0.15％溶液浸泡2-4min灭菌；使用无菌手术刀切成长度为0.8-1.5cm的段或块。
13.优选地，所述步骤s2中，不定芽诱导培养基为ms+1.5-2.5mg/l6-ba，培养基ph5.8-6.0，叶片、叶柄和根组织三种外植体均能诱导出不定芽。
14.优选地，所述步骤s3中，生根培养基为：1/2ms+0.1-0.2mg/lnaa，蔗糖10-20g/l，培养基ph5.8-6.0。
15.优选地，所述步骤s3中，生根培养基为：1/2ms+0.1-0.2mg/lnaa，蔗糖15g/l，培养基ph5.8-6.0。
16.优选地，所述步骤s2、s3中，诱导、生根的组培室环境条件为温度24
±
2℃、光照12h/d、光照强度2000-3000lx。
17.优选地，所述步骤s4中，基质为泥炭：河沙按照质量比为1：(0.5-1.5)混匀。
18.本发明的有益效果是：
19.1、本发明简化了自诱导愈伤组织培养基转接至不定芽分化培养基的步骤，不经过愈伤组织诱导过程，直接诱导不定芽，减少了工作量和能源消耗，操作简便，经济有效，实用性好，填补了国家二级保护植物丰都车前在组培快繁的研究空白，有效解决了丰都车前因野外分布区域窄而濒临灭绝的现状，能够为丰都车前的物种的保护、新品种的培育等提供技术支持。
20.2、本发明意外的发现不定芽的诱导剂只有单独采用6-ba时，后期进行生根培养的时候，效果是最好的。
附图说明
21.图1丰都车前叶片诱导愈伤组织；
22.图2丰都车前根组织诱导不定芽；
23.图3丰都车前叶片诱导不定芽；
24.图4丰都车前叶柄诱导不定芽；
25.图5丰都车前不定芽初始生根情况；
26.图6丰都车前不定芽生根后期情况；
27.图7丰都车前组培苗移栽前；
28.图8丰都车前组培苗移栽后生长情况。
具体实施方式
29.以下将结合附图以及具体实施例对本发明进行详细说明，以使得本发明的技术方案及其有益效果更为清晰明了。可以理解，实施例及附图仅提供参考与说明，是为了更好的解释本发明而不是用于限制本发明。除非有特别的说明，否则本发明所述的科技术语具有的含义和权利与所属领域的科技工作者通常所理解的含义相同。
30.实施例1
31.1实验材料
32.材料来自长江珍稀植物研究所在长江流域调查并迁地保护的丰都车前，保育在植物研究所基地。
33.2组培快繁方法
34.2.1叶片、叶柄或根组织外植体消毒
35.分别采集非当年生、当年生丰都车前幼嫩的叶片、叶柄、根组织，用自来水冲去外植体上的灰尘，在超净工作台上将外植体用表1中的方法灭菌，随后使用无菌水洗涤4-5次，将材料转移到无菌滤纸上吸去水分，使用无菌手术刀或剪刀剪切成长度为1cm左右的段或块。
36.表1不同消毒方法对丰都车前外植体的影响
[0037][0038][0039]
2.2诱导外植体产生愈伤组织
[0040]
在超净工作台上将准备好的外植体接种在以ms为基本培养基，施加不同浓度6-ba和2，4-d的培养基上，如表2。接种后置于组培室内培养，组培室环境条件为温度24
±
2℃、光照12h/d、光照强度2000-3000lx。
[0041]
表2不同植物生长调节剂配比对愈伤组织诱导的影响
[0042]
序号6-ba(mg/l)2，4-d(mg/l)10.11.020.12.030.13.040.21.050.22.060.23.070.31.080.32.090.33.0
[0043]
2.3诱导愈伤组织和外植体产生不定芽
[0044]
在超净工作台上将2-2中外植体诱导出的愈伤组织及准备好的新的外植体接种在以ms为基本培养基，施加不同浓度6-ba的培养基上，如表3。接种后于组培室内进行培养，组培室环境条件为温度24
±
2℃、光照12h/d、光照强度2000-3000lx。
[0045]
表3不同浓度的6-ba对丰都车前外植体分化的影响
[0046]
序号6-ba(mg/l)11.021.532.043.0
[0047]
2.4不定芽生根
[0048]
选取丰都车前外植体分化出的健壮不定芽，分别接种于以ms、1/2ms(蔗糖为15g/l)为基本培养基，附加不同浓度的naa的培养基上，见表4。接种后于组培室内培养，组培室环境条件为温度24
±
2℃、光照12h/d、光照强度2000-3000lx。
[0049]
表4不同基本培养基和不同浓度naa对丰都车前不定芽生根的影响
[0050][0051]
2.5组培苗移栽
[0052]
当试管苗发育成根、茎、叶俱全的完整植株后，选取植株高度大于2cm、叶浓绿、根系生长旺盛的组培苗进行移栽。移栽时先将培养瓶瓶盖打开，置于生长室内进行炼苗，3-5天后，将根部琼脂清洗干净，清洗过程中避免伤及根系，随后分别移栽到泥炭、泥炭：河沙＝1：1混匀、泥炭：河沙＝2：1混匀、河沙四种不同的基质中，浇透水，置于生长室或温室中养护。
[0053]
2.6数据处理
[0054]
分化率＝分化产生不定芽的外植体数/接种外植体数*100％
[0055]
增殖系数＝分化的不定芽数量/接种外植体数
[0056]
生根率＝生根的外植体数/接种外植体数*100％
[0057]
3结果
[0058]
3.1不同消毒方法对丰都车前外植体的影响
[0059]
不同消毒方法对丰都车前外植体的灭菌效果如表5，由表可知采用75％酒精10s+无菌水洗涤4次+0.1％溶液浸泡5min的灭菌方式会导致外植体变暗并趋向死亡，0.1％溶液浸泡5min不能有效对非当年生丰都车前外植体灭菌；采用0.1％溶液浸泡当年生丰都车前外植体2min，外植体接种后污染率较高，0.1％溶液浸泡丰都车前外植体3min，既能有效灭菌又不会对外植体造成伤害。因此，用0.1％溶液浸泡当年生丰都车前幼嫩组织3min灭菌的材料最适合用于丰都车前组培快繁。
[0060]
表5不同消毒方法对丰都车前外植体的影响
[0061]
[0062][0063]
3.2诱导外植体产生愈伤组织结果统计与分析
[0064]
将外植体接种后定期观察记录其状态(图1)。丰都车前外植体产生愈伤组织的诱导率较低，仅为50％～60％。
[0065]
将愈伤组织接种到诱导产生不定芽的培养基后，定期观察记录其状态。愈伤组织接种后分化率较低，大部分的愈伤组织老化、变黑甚至死亡，只有个别愈伤组织分化出不定芽，且分化出不定芽的时间较长，从诱导愈伤组织到诱导出不定芽约需要50天。因此，通过诱导愈伤组织建立丰都车前组培快繁体系的方法工作量较大，操作复杂且实用性低。本发明后期不经过愈伤组织诱导。
[0066]
3.3诱导外植体直接产生不定芽结果统计与分析
[0067]
将外植体接种后定期观察记录其状态。将根组织接种20天左右后，开始分化出不定芽(图2)，30天后统计分化率及增殖系数，结果记录见表6，叶片和叶柄接种30天左右后，开始分化出不定芽(图3、图4)，45～50天后统计分化率及增殖系数，结果记录分别见表7、表8。
[0068]
表6不同浓度的6-ba对丰都车前根组织直接分化的影响
[0069]
序号6-ba(mg/l)分化率/％增殖系数长势11.020.00.5++21.565.02.2+++32.090.04.0+++43.070.03.1+
[0070]
注:+++为长势好，++为长势较好，+为长势一般
[0071]
表7不同浓度的6-ba对丰都车前叶片直接分化的影响
[0072][0073][0074]
注:+++为长势好，++为长势较好，+为长势一般
[0075]
表8不同浓度的6-ba对丰都车前叶柄直接分化的影响
[0076]
序号6-ba(mg/l)分化率/％增殖系数长势
11.035.00.6++21.560.01.4+++32.075.02.2+++43.070.01.8+
[0077]
注:+++为长势好，++为长势较好，+为长势一般
[0078]
由表6、表7、表8可以看出，随着6-ba浓度的升高，不定芽的分化率先升高后降低，当6-ba浓度为2.0mg/l，外植体分化率及增殖系数达到最高，且增殖系数根组织与叶片较高，叶柄较低，但根组织分化出不定芽的时间短于叶片和叶柄。当6-ba浓度达到3.0mg/l，随着外植体培养时间的延长，不定芽逐渐出现黄化现象。
[0079]
3.3丛生芽生根结果统计与分析
[0080]
将在施加不同浓度6-ba的培养基上诱导出的不定芽接种后定期观察记录生长状态(图5、图6)。不定芽接种5天左右后，开始生根，接种15天后统计不定芽的生根率、生根数量及根长，结果如表9、表10。
[0081]
表9 ms培养基加不同浓度的naa对丰都车前不定芽生根的影响
[0082]
序号naa(mg/l)生根率/％平均生根数平均根长(cm)长势10.05350.90.3+20.10701.30.5++30.15902.71.1++40.20751.60.5+
[0083]
注:+++为长势好，++为长势较好，+为长势一般
[0084]
表10 1/2ms培养基加不同浓度的naa对丰都车前不定芽生根的影响
[0085][0086][0087]
注:+++为长势好，++为长势较好，+为长势一般
[0088]
由表9可以看出，将丰都车前不定芽接种在ms加不同浓度的naa的培养基中生根较慢，长势一般；由表10可以看出，接种在1/2ms加不同浓度的naa的培养基中生根较快，长势好，随着naa浓度的升高，不定芽的生根率先升高后降低，当naa浓度为0.15mg/l，生根率可达到100％，生根数量和根的平均长度均优于其他浓度。
[0089]
3.4组培苗移栽结果
[0090]
选取生长旺盛的丰都车前组培苗(图7)移栽到不同的基质后，观察记录生长状态(图8)，统计成活率，结果如表11。
[0091]
表11不同基质对丰都车前组培苗移栽生长的影响
[0092]
基质成活率/％长势
泥炭90++泥炭：河沙＝1：1100+++泥炭：河沙＝2：195++河沙80+
[0093]
注:+++为长势好，++为长势较好，+为长势一般
[0094]
由表11可以看出，将丰都车前组培苗在泥炭：河沙＝1：1混匀的基质中成活率可达100％，且长势最好。
[0095]
综上所述，采集当年生丰都车前幼嫩的叶片、叶柄和根组织，用自来水冲去叶片上的灰尘，在超净工作台将外植体用0.1％溶液浸泡3min灭菌；使用无菌手术刀切成长度为1cm的段或块，接种于ms+2.0mg/l6-ba的不定芽诱导培养基上，培养基ph5.8-6.0，叶片、叶柄和根组织三种外植体均能诱导出不定芽；将诱导出的不定芽接种于1/2ms+0.15mg/lnaa的生根培养基上，蔗糖15g/l，培养基ph5.8-6.0，生根率率达100％；最后挑选生长健壮的组培苗移栽到泥炭：河沙＝1：1混匀的基质中，成活率达100％。
[0096]
实施例2
[0097]
以实施例1为基础，进行如下实验，前期操作同实施例2.1-2.2。
[0098]
1.诱导愈伤组织和外植体产生不定芽
[0099]
在超净工作台上将实施例1中2-2中外植体诱导出的愈伤组织及准备好的新的外植体接种在以ms为基本培养基，施加不同浓度6-ba和iba的培养基上，如表12。接种后于组培室内进行培养，组培室环境条件为温度24
±
2℃、光照12h/d、光照强度2000-3000lx。
[0100]
表12不同浓度的6-ba和iba对丰都车前外植体分化的影响
[0101]
序号6-ba(mg/l)iba(mg/l)11.00.121.50.332.00.543.00.7
[0102]
2.诱导外植体直接产生不定芽结果统计与分析
[0103]
将愈伤组织接种在施加不同浓度6-ba和iba的培养基上，诱导产生不定芽，定期观察记录发现，愈伤组织接种后分化率较低，大部分的愈伤组织老化、变黑甚至死亡。
[0104]
将外植体接种在施加不同浓度6-ba和iba的培养基上，定期观察记录其状态。将根组织接种20天左右后，开始分化出不定芽，30天后统计分化率及增殖系数，结果记录见表13，叶片和叶柄接种30天左右后，开始分化出不定芽，50天后统计分化率及增殖系数，结果记录分别见表14、表15。
[0105]
表13不同浓度的6-ba和iba对丰都车前根组织直接分化的影响
[0106]
序号6-ba(mg/l)iba(mg/l)分化率/％增殖系数长势11.00.120.00.5++21.50.360.01.8+++32.00.585.03.1+++43.00.765.02.6+
[0107]
注:+++为长势好，++为长势较好，+为长势一般
[0108]
表14不同浓度的6-ba和iba对丰都车前叶片直接分化的影响
[0109][0110][0111]
注:+++为长势好，++为长势较好，+为长势一般
[0112]
表15不同浓度的6-ba和iba对丰都车前叶柄直接分化的影响
[0113]
序号6-ba(mg/l)iba(mg/l)分化率/％增殖系数长势11.00.130.00.5+21.50.345.01.2++32.00.550.01.9++43.00.735.00.7+
[0114]
注:+++为长势好，++为长势较好，+为长势一般
[0115]
由表13-表15可以看出，随着6-ba和iba浓度的升高，不定芽的分化率先升高后降低，且增殖系数根组织＞叶片＞叶柄；以根为外植体时，当6-ba浓度为2.0mg/l，iba浓度为0.5mg/l，外植体分化率及增殖系数达到最高，分别为85％、3.1。
[0116]
3.丛生芽生根结果统计与分析
[0117]
将施加不同浓度6-ba和iba的培养基上诱导出的丰都车前不定芽接种后定期观察记录生长状态。生根的条件同实施例1最佳条件(将诱导出的不定芽接种于1/2ms+0.15mg/lnaa的生根培养基上，蔗糖15g/l，培养基ph5.8-6.0，生根率率达100％；最后挑选生长健壮的组培苗移栽到泥炭：河沙＝1：1混匀的基质中)，不定芽接种7天左右后，开始生根，接种15天后统计不定芽的生根率、生根数量及根长，结果如表16、表17。
[0118]
表16 ms培养基加不同浓度的naa对丰都车前不定芽生根的影响
[0119]
序号naa(mg/l)生根率/％平均生根数平均根长(cm)长势10.05300.60.2+20.10551.10.4++30.15752.00.9++40.20701.40.6+
[0120]
注:+++为长势好，++为长势较好，+为长势一般
[0121]
表17 1/2ms培养基加不同浓度的naa对丰都车前不定芽生根的影响
[0122]
[0123][0124]
注:+++为长势好，++为长势较好，+为长势一般
[0125]
由表16和表17可以看出，将施加不同浓度6-ba和iba的培养基上诱导出的丰都车前不定芽接种在生根培养基后，芽生根数量较少，且根的伸长速度较慢，植株长势一般；随着naa浓度的升高，不定芽的生根率先升高后降低；在1/2ms培养基上，当naa浓度为0.15mg/l，生根率最高，为85％。
[0126]
通过实施例1和实施例2的对比分析，不定芽诱导培养基中的植物生长调节剂是仅添加6-ba且浓度为2.0mg/l时，不定芽的分化率和增殖系数更高，诱导出的不定芽在生根培养基上成活率和长势最好，且直接诱导不定芽不需要经过愈伤组织，这可能是因为每种植物生长调节剂都有特定的用途，只有在特定的施用条件下才能对特定的植物产生特定的功效，外植体在添加了不同种类和浓度植物生长调节剂的培养基上生长时，吸收的外源植物生长调节剂打破了其生长平衡，从而不利于植物后期的生长。
[0127]
上述的实施例仅为本发明的优选技术方案，但本发明的保护范围并不局限于此。本技术中的实施例及实施例中的特征在不冲突的情况下，可以相互任意组合。本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围。任何熟悉本领域的技术人员在本发明所披露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换改进，也涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.一种国家二级保护植物丰都车前组培快繁的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：s1：采集当年生丰都车前幼嫩的叶片、叶柄和根组织，用自来水冲去外植体上的灰尘，将外植体灭菌；使用无菌手术刀切成段或块；s2：接种在不定芽诱导培养基上，叶片、叶柄和根组织三种外植体诱导出不定芽；s3：将诱导出的不定芽接种于生根培养基上；s4：挑选生长健壮的组培苗移栽到基质中，完成国家二级保护植物丰都车前组培快繁。2.根据权利要求1所述的国家二级保护植物丰都车前组培快繁的方法，其特征在于，所述步骤s1中，外植体用0.05-0.15%溶液浸泡2-4 min灭菌；使用无菌手术刀切成长度为0.8-1.5cm的段或块。3.根据权利要求1所述的国家二级保护植物丰都车前组培快繁的方法，其特征在于，所述步骤s2中，不定芽诱导培养基为ms+1.5-2.5 mg/l6-ba，培养基ph5.8-6.0，叶片、叶柄和根组织三种外植体均能诱导出不定芽。4.根据权利要求1所述的国家二级保护植物丰都车前组培快繁的方法，其特征在于，所述步骤s3中，生根培养基为：1/2ms+0.1-0.2 mg/lnaa，蔗糖10-20 g/l，培养基ph5.8-6.0。5.根据权利要求4所述的国家二级保护植物丰都车前组培快繁的方法，其特征在于，所述步骤s3中，生根培养基为：1/2ms+0.1-0.2 mg/lnaa，蔗糖15g/l，培养基ph5.8-6.0。6.根据权利要求1所述的国家二级保护植物丰都车前组培快繁的方法，其特征在于，所述步骤s2、s3中，诱导、生根的组培室环境条件为温度24
±
2℃、光照12h/d、光照强度2000-3000lx。7.根据权利要求1所述的国家二级保护植物丰都车前组培快繁的方法，其特征在于，所述步骤s4中，基质为泥炭：河沙按照质量比为1：（0.5-1.5）混匀。

技术总结

本发明提供一种用于濒危植物丰都车前高效繁育的方法。采集当年生丰都车前幼嫩的叶片、叶柄和根组织，用自来水冲去外植体上的灰尘，将外植体灭菌；使用无菌手术刀切成段或块；接种在不定芽诱导培养基上，叶片、叶柄和根组织三种外植体诱导出不定芽；将诱导出的不定芽接种于生根培养基上；挑选生长健壮的组培苗移栽到基质中，完成国家二级保护植物丰都车前组培快繁。本发明简化了自诱导愈伤组织培养基转接至不定芽分化培养基的步骤，不经过愈伤组织诱导过程，直接诱导不定芽，减少了工作量和能源消耗，操作简便，经济有效，实用性好。实用性好。实用性好。