流式细胞术( Flow cytometry, FCM), 临床上也被称为流式细胞分析,是利用流式细胞仪同时对单个细胞的多个参数进行定性/ 定量( 相对/ 绝对) 分析的生物医学分析技术,检测速度快、通量高、灵敏度高、采集数据量大、节约样本及成本,在临床上已经广泛应用于血液学、免疫学、肿瘤学、精子学等检验领域,是未来临床检验不可替代的检测方法之一。传统流式细胞术,也被称为荧光流式细胞术,是 基于荧光标记及荧光发射光谱检测的一门综合性技术,定量方式多为定性分析,检测参数类型单一、数目有限,数据分析复杂且缺乏标准化分析流程,不同检测中心间数据重现性差,这些都限制了它在临床检验中进一步的推广及应用。 近年来,为克服以上问题,流式细胞术不断突破与创新,从定性检测发展为定量检测;从单参数分析磁分离、双参数分析发展成为多参数分析;从检测细胞表面抗原到胞内抗原及分泌到胞外的抗原;从检测蛋白表达水平发展为检测蛋白定位、蛋白功能及蛋白翻译后修饰等;从一维定量检测发展为二维定量定位分析,从体外检测发展为体内检测等;这些突破使得流式细胞术可以实现从单细胞水平去认识细胞在生理或病理状态下的免疫表型、分子表型甚至各种复杂的信号通路变化等,因此将更为广泛应用于临床检测。
1定量流式细胞术
定量流式细胞术( Quantitative flow cytometry, QFCM),即通过流式细胞仪定量检测细胞或微球上荧 光 素 的 中 值 荧 光 强 度 ( Median fluorescent intensity, MFI ) 或 每 个 细 胞 结 合 的 抗 体 单 位 ( Antibodies bound to per cell,ABC) 来对生物分子进行相对或绝对定量的流式细胞技术。 定量流式细胞术已被证明是一种功能强大的临床检验技术,但由于 MFI 缺乏标准化度量方法,容易引起不同检测中心检测结果重现性差,导致诊断和决策的不确定性及不可靠性, 限制了其在临床的推广应用, 因此,标准化 MFI 测量为流式细胞术实现精确定量分析,在临床广泛应用的必经之路。 目前,在临床应用过程中,为提高检测结果的准确性及重现性,定量流式细胞术必须做到以下几点:淤样本及试剂处理严格按照标准操作规程,每一次检测必须设置质控管; 于流式细胞仪维护及校准。 每一次检测前进行仪器校准;盂检测流程标准化及规范化;榆数据分析自动化。 流式检测数据量庞大,分析难度大,经验性强, 人工分析存在主观性和低保真度等特点。 实现机器操控及数据分析的标准化、自动化将会大大提高检测数据的再现性及可靠性。
2多流式细胞术
多流式细胞术 ( Multicolor flow cytometry, MFC) 是指利用超过三种的荧光素实现多个参数同时检测的流式细胞技术。 近年来,随着流式细胞仪硬件( 激光管、滤光片等)、软件( 数据分析等) 的不断改进,荧光素的不断开发及应用,临床诊断领域的不断发展及需求,MFC 应运而生。 大部分临床检验中心的流式细胞仪具备 2 ~ 3 个激光器,可以同时检测 9 ~ 10 荧光,甚至出现了 5 激光 20 参数同时检测的流式细胞仪。 多流式细胞术可以快速准确高灵敏的检测细胞内多个指标,实现从复杂样本中识别罕见细胞,为疾病诊断、药物开发等提供了强大的工具,是流式细胞术未来发展的主要趋势,也是流式细胞术在临床应用的主要方向。 但由于结果分析的复杂性,MFC 目前在临床应用中还主要是作为探索或辅助手段。 例如,吴江等[1] 利用多流式细胞术分析急性 HIV 感染者外周血 酌啄T 细胞的表型,探索哪一种 酌啄T 细胞在急性 HIV 感染及疾病进展中发挥重要作用。 流式细胞术评分系统经常被整合到疾病诊断和预后评分系统中,辅助精细评分。 例如, 基于 CD79b( 或 CD22 )、CD23、CD5、FMC7 及 SmIg检测的流式细胞术免疫分型评分参与辅助诊断慢性淋巴细胞白血病[2] ;利用 MFC 检测骨髓祖细胞侧向角散射光、CD117 表达以及单核细胞 CD13 表达等参数建立的流式检测积分系统可以补充目前的骨髓增生异常综合征国际预后评分系统( IPSS鄄R),实现更为精确的预后评估[3] ;利用 MFC 检测分析来自骨髓的造血细胞的免疫分型可
以辅助慢性髓细胞白血病的诊断、预后和[4] ;利用 MFC 检测白血病细胞表面分化抗原可以辅助白血病分型诊断及白血病微小残留物诊断[5] ;基于 GPI 锚连蛋白缺失检测的 MFC 可以辅助阵发性睡眠性血红蛋白尿症诊断;基于多种分子标记物[ 血小板特异性膜糖蛋白( GP域b / 芋a、GP玉b鄄御鄄吁、GP玉a / 域a 等)、血小板颗粒膜糖蛋白( CD62P、CD63、CD107a、CD107b 等)]、Ca2+ 流及 RNA 含量等检测的 MFC 可以辅助血小板功能分析等
3磷酸化流式细胞术
磷酸 化 流 式 细 胞 术 ( Phospho鄄specific flow cytometry,Phospho鄄flow),是指高通量检测单个细胞内多个磷酸化蛋白的流式细胞术。 细胞信号通路中关键因子的磷酸化水平是细胞信号转导研究的重要内容,而经典的生化方法对信号通路的分析非常有限,因为它不仅只能一次检测一个蛋白的磷酸化水平,并且获得的结果为一细胞内蛋白磷酸化水平的平均值,这一方面无法实现细胞内信号网络的全面分析,另一方面在面对异质细胞体时也很难获得准确的结果,而磷酸化流式细胞术很好地克服了这些难题,它借助于多种信号分子的磷酸化抗体,在单个细胞水平上同时分析细胞内多个蛋白因子的磷酸化水平,从而获得更高水平的信号转导动力学,实现单个细胞内信号通路的全面分析。
Phospho鄄flow 已经广泛应用于多个领域,包括抗原或微生物刺激下免疫应答过程中的信号通路研究、癌症及自身免疫性疾病相关信号通路研究、疾病相关标记物及药物的高通量筛选等。 例如: 利用Phospho鄄flow 检测 CD3 阳性 T 细胞中的核糖体 S6蛋白磷酸化水平来进行心脏移植患者 mTOR 抑制剂依维莫司药物的监测[7] ; 利用 Phospho鄄flow检测肝移植患者外周血单核细胞 ( PBMCs ) 中 p70S6K 磷酸化水平来评估西罗莫司药效学敏感性[8] ;利用 Phospho鄄flow 测定主动脉瓣狭窄小鼠模型中的循环白细胞和血小板鄄白细胞聚集体( PLA) 中的 Smad2 / 3 磷酸化水平来探究 TGF鄄茁1 活化在该病发病中的作用[9] ;利用 Phospho鄄flow 筛选 JAK2 抑制剂 fedratinib( FED) 在急性髓系白血病( AML) 患者体内的应答的生物标志物,筛选出 STAT5 磷酸化水平作为具有高特异性和强阳性预测值的药物生物标志物等
4流式微球分析技术
流式微球分析技术 ( Cytometric bead assay, CBA),指利用类似于细胞大小的微球( 如聚苯乙烯微球、磁性微球等) 作为载体,以流式细胞仪作为检测平台,对液体中可溶性成分进行高通量快速分析的一门新技术。 传统的 CBA 技术的工作原理是将多种捕获抗体包被在具有
不同荧光强度的微球上形成捕获微球,与待测样品溶液混合后,微球上包被的抗体就与样品中对应的抗原结合,再加入荧光素标记的检测抗体,形成类似“ 三明治冶的检测复合物,采用流式细胞仪进行检测,微球上结合的待测抗原或抗体分子数量与其荧光强度呈线性关系,由此可对待测液体中与微球上包被的抗体分子相对应的抗原进行定性或定量分析。 CBA 是集 ELISA 和流式细胞技术优点于一身的液相蛋白分析系统,具有检测通量大、样本用量少、速度快、检出限低等特点,为一个高度灵活的多元分析平台,已被用于疾病监测、药物开发、食品安全、环境监测等诸多领域。
近年来,该技术发展迅速,在重复性、检测通量及灵敏度等方面都取得了较大的突破, 如今, CBA 技术可以实现同一样本中高达 70 个蛋白的精确绝对定量,检测灵敏度可以达到 10-1 pg / ml,检测时间仅需要 3郾 5 h。 除此之外,在以下两方面也有较大的突破:(1) 检测指标类型。 传统CBA 技术,主要适用于检测具有完全免疫原性的大分子物质。 例如:检测微量样本( 血液、眼泪、血清、唾液等) 中的细胞因子,血浆中炎症因子的水平,细胞信号转导蛋白,凋亡相关蛋白等。 例如,Waleed 等[11] 利用 CBA 技术检测了中东呼吸综合征冠状病毒 MERS鄄CoV 感染后 T 辅助( Th)1、Th2 和 Th17 细胞因子( IFN鄄酌、IFN鄄琢2、IL鄄2、IL鄄4、IL鄄5、IL鄄12、IL鄄13、TNF鄄琢、IL鄄15 和 IL鄄17 等) 水平;庞盼等[12] 利用CB
A 技术检测细胞因子转化生长因子鄄茁 和白细胞介素鄄10 在布鲁氏菌病( Brucellosis) 患者血清中的变化,探究布鲁氏菌感染后的免疫调控机制;近年来,CBA 技术在痕量小分子物质( 相对分子质量<1 kD),例如中药小分子成分、真菌毒素、农药残留等的检测方面也取得了快速进展[13] 。 例如,Xiao 等[14] 开发了一种基于磁性微球的 CBA 方法,用于快速及高灵敏度地检测麦芽中的痕量赭曲霉毒素 A,检测极限低至 0郾 025 滋g / kg。Sandra 等[15] 开发了同样基于磁性微球的 CBA 方法,用于可靠且快速的检测同一食物样本中的多种葡萄球菌肠毒素 B,为筛选食物中金黄葡萄球菌和/ 或肠毒素提供了新的思路与方法。 (2 ) 微球类型。 传统 CBA 技术常采用普通聚苯乙烯微球,操作工艺复杂,经过洗涤,离心,偶联和免疫反应等步骤后,微球回收率通常较低, 不利于进行多重检测分析。 近年来,磁性微球作为相对新型的固体载体,由于具有以下优势而得到了广泛推广及使用。 淤简化操作流程。 基于其磁性,磁性微球可使 CBA 技术操作流程更加高效、自动化、可并行化及可控;于提高了检测灵敏度和特异性;盂磁分离剪切力较低,不会影响抗原鄄抗体结合和洗涤过程中蛋白质的构象和功能;榆可与探针分子结合等。 基于这些突破,借助于流式强大的数据分析软件,CBA 技术可以实现高通量、高灵敏度及高精确度的定量检测分析,将更为广泛应用于免疫疾病监控、肿瘤研究、药物研发及药效评估、疫苗研究、总体免疫功能分析等众多领域。
5质谱流式细胞术
传统的荧光流式细胞术是基于荧光发射光谱的检测,但荧光基团发射光谱一般较宽, 多参数检测时,不同荧光素发射光谱之间往往会发生重叠,这会导致两方面问题:淤检测通量受限;于检测难度提高。 为了保证数据精确,多参数检测时必须进行荧光补偿调节,大大增加了检测的复杂性,为传统荧光流式细胞术难以攻克的技术难题,而质谱流式细胞术( Mass Cytometry) 恰能很好地解决这一难题。
Mass Cytometry 是利用金属元素标记抗体取代了荧光素标记抗体,利用质谱检测取代荧光发射光谱检测的新兴流式细胞术。 与荧光流式细胞技术相比,质谱流式细胞技术主要有两点不同: 第一, 抗体标记系统不同。 前者使用荧光素作为抗体标记物,后者则使用金属元素作为标记物;理想的标记物需要满足四个特点:淤生物样本中含量低;于无放射性;盂易于标记及检测;榆种类多。 金属元素,在细胞中含量极低,且与细胞的非特异性结合少,检测背景低;目前已发现的金属元素种类超过 100 种,已用在 Nature Protocols 杂志上发表了利用质谱流式细胞术分析小鼠脑室免疫细胞的方法,并详细描述了操作流程,包括脑灌注、脑组织提取及其单细胞悬液制备,利用金属标记的抗体进行细胞染,使用质谱细胞仪读取数据等步骤。 整个
操作过程仅需要不到5 h( 不包括数据分析),并且指出该方法不仅可以在正常和病理条件下监测大脑免疫体的变化,还可以推广至脊髓免疫细胞分析等[16] 。 Schulz 等[17] 利用质谱流式细胞术检测乳腺癌组织中的 3 种mRNA 靶标分子和 16 种蛋白质,并指出这种多重检测方法将允许灵活的从患者样本中提取可用于诊断或的目的信息,可以实现更为详细的肿瘤生物学样本研究,并将作为一种全面的基因组学和蛋白质组学分析的工具。
6成像流式细胞术
流式细胞术的以上进展都停留在“ 量冶这一个维度,研究者获得的细胞信息非常有限,对细胞的了解只基于检测散点图上的一个点,而不是真实的细胞图像,无法获得细胞形态学、检测指标的亚细胞定位等信息,无法更加立体完整地鉴别细胞。 成像流式细胞术( Imaging flow cytometry,IFC) 攻克了这一技术瓶颈。
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