中，兽医科学 2021，51 (03):343-348
Chinese Veterinary Science网络首发时间：2021-01-12 D O I：10.16656/j.issn. 1673-4696.2021.0053 中图分类号：S852.72 文献标志码：A文章编号：1673-4696 (2021)03-0343-06
马巧妮\王萌，张海生、朱兴全
(i.中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病
重点实验室，甘肃兰州730046;2.山西农业大学动物医学学院，山西太谷030801)
摘要：弓形虫是一种广泛流行的人兽共患寄生原虫，可感染全球约三分之一的人和绝大多数温血动物，是引起人兽共患原虫病的重要病原之一。弓形虫的终末宿主为猫科动物，其在弓形虫的流行和传播中发 挥着重要作用。猫科动物排泄的粪便中若含有感染性的弓形虫卵囊，这些卵囊便可在一定条件下分散到自 然环境中并污染水体、土壤、瓜果蔬菜等，从而造成危害严重的食源性污染。人或动物有可能在活动过程 中接触被弓形虫卵囊污染的土壤或摄取被卵囊污染的食物或水源而感染。本文系统地综述了环境中弓形虫 卵囊的富集和检测技术，以期为进一步建立更快速、灵敏的检测方法提供新的思路。
关键词：弓形虫；卵囊；环境；富集；检测技术
Research progress in enrichment and detection technologies for
Toxoplasma gondii in the environment
MA Qiao-ni1, WANG Meng1* ,ZHANG Hai-sheng1 ,ZHU Xing-quan12*
(1.Stale Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology/Key Laboralory of Veterinary Parasitology of Gansu Province/
Lcmzhou Veterinary Research I n s t i t u t e,Chinese Academy of A griculture Sciences ,Lanzhou730046, China；
2.College of Veterinary Medicine ,Shanxi Agricultural University yTaigu030801,China)
Abstract：Toxoplasma gondii,an obligate intracellular parasitic protozoon,distributes widely throughout the world. It is one of the most important pathogens causing zoonotic protozoan diseases, resulting in infection of approximately one third of the human population worldwide and most
warm-blooded animals. Felids are the only definitive hosts that play a key role in the prevalence and
transmission dii.The feline feces can release the dii oocysts that may spread into the environment under an appropriate condition and then contaminate water,soil,fruits and vegetables,which would cause severe and harmful foodborne contamination. Infection of humans or animals may be caused by contact with polluted soil or by ingestion of oocysts-contaminated food or water supplies during external activities. In this review,we systematically summarize the enrichment and detection techniques dii oocysts in order to provide insight into the further studies on establishing more rapid and sensitive detection methods.
Key words：Toxoplasma gondii；oocyst ；environment ；enrichment diagnostic technology
收稿日期：2020-ll-16；修回日期：2021-01-13
基金项目：国家自然科学基金项目（Grant No. 32002306)；中国农业科学院科技创新工程项目（Grant No. CAAS-ASTIP-2016- LVRI-03)
作者简介：马巧妮（1993-)，女，陕西西安人，硕士生，研究方向为动物寄生虫及其分子生物学，E-mail :maxintanl228@gmai 1.
com。*通讯作者：王萌，助理研究员，博士，主要从事动物寄生虫及其分子生物学研究，E-mail :wangmeng02@
caas. cn；朱兴全，教授、博士、博导，主要从事动物寄生虫及其分子生物学研究，E-mail ixingquanzhul^'hot-
mail. cora0
344中国兽医科学第51卷
* Corresponding authors：WANG Meng,E~mai 1,wangmeng02@caas. cn；ZHU Xing-quan,E-mai 1,xingquan- zhul@hotmail. com
刚地弓形虫是一种广泛分布于世界各地的专性 胞内寄生性原虫，可感染几乎所有的温血动物和全 球约30%的人、大多数健康的人感染弓形虫后 通常无症状，但感染具有潜伏性，且能长期存活于宿 主体内，例如寄生于大脑和肌肉中X。免疫功能低下 者感染可危及生命，其中最严重的表现是脑炎和脑 脓肿3。另外，妊娠妇女感染后可导致先天性弓形虫 病，其危害主要表现为胎儿严重畸形和自然流产；新 生儿出生时可能无症状，但在以后的生活中会伴有 学习障碍、精神疾病和眼病等
刚地弓形虫的生活史复杂，猫为弓形虫的终末 宿主，人以及犬、猪等家养动物都是其中间宿主。在 中间宿主中，弓形虫以组织包囊的形式存在，人可通 过食用含有弓形虫的组织包囊的生肉或未煮熟的肉 而感染。猫科动物通常在感染弓形虫后会排泄大量 的卵囊5]，这些卵囊会伴随粪便进入环境并在一定
条件下发育成为感染性的孢子化卵囊，从而在环境 中造成水源、土壤、瓜果和蔬菜等的污染。最新的研 究表明，人类急性弓形虫病的暴发与环境卵壤污染 有关|6:，主要通过摄人被弓形虫卵囊污染的食物或 接触被卵囊污染的土壤或地表水而感染_「。环境中 的孢子化卵囊具有很强的生命力，它们能抵抗不利 的环境因素和化学侵蚀，在水中能存活54个月，在 土壤中可存活达24个月之久81〜。曾经在世界范围 内发生的几次危害严重的弓形虫病疫情，已证实了 被弓形虫卵囊所污染的土壤或水可直接引起人类和 动物感染〜'杜芬等正实武汉公园土壤中弓形虫卵囊的存在，并指出土壤可能是人和动物感染弓 形虫的重要传染源之一。
虽然环境中的弓形虫对人类和动物的健康构成 了很大威胁，但由于缺乏在环境中检测弓形虫的标 准方法，跟踪弓形虫在环境中的运输机制和确定污 染源仍有很大闲难16;。因此，建立快速、灵敏、特异 的检测方法至关重要。近年来，随着分子生物学技 术的不断发展，越来越多的分子生物学技术如实时 荧光定量PCR、套式PCR、环介导等温扩增（LAMP)、重组酶聚合酶扩增（RPA)等技术已被应用于弓形虫 的检测中，极大地提高了弓形虫卵囊检测的特异性 和敏感性，解决了用传统的显微技术检测弓形虫卵 囊特异性和敏感性不高的问题。然而，由于构成 自然环境的物质种类很多，包括空气、水、植物、动物、土壤和岩石矿物等〜。这也决定了环境要素成分的复杂性。例如土壤和水体中都含有各种杂质颗 粒以及微生物体。因此，在对环境中的弓形虫卵 囊进行检测之前有必要对卵囊进行富集处理，以提 高卵囊的检出率。本文对近年来环境中弓形虫卵囊 富集以及检测方法的研究进展进行综述，旨在为进 一步研发更加快速、灵敏的检测方法提供新的思路。
1环境中弓形虫卵囊的富集
1.1环境中弓形虫卵囊采样
环境中弓形虫卵囊的污染非常普遍，其中卵囊 对水源和土壤的污染尤为常见在水中，弓形虫 卵囊具有特殊重力，使得它们最有可能停留在水 底:24:。在土壤中，弓形虫卵囊存在于土壤表面或深 达10 cm的土壤层中〜，而卵囊在土壤中的转移仍 然未知。由于污染源难以确定，因此选择合适的环 境采样点是进行弓形虫流行病学调查的重要前提。猫科动物在公共场所活动较为频繁，尤其是一些潮 湿和阴凉的地方，例如公园、家庭后院、农场周围的 草地、水源地、池塘等，可能是存在卵囊环境污染的 重要地点。此外，由于卵囊可能在土壤或水中分布 不均，因此样本量应尽可能大，以提高卵囊的检出 率。根据现有的研究报道，各种浑浊的水样应该至 少采集50〜100 L；而固体基质样品（土壤、水果、蔬 菜等)应至少采集100 g」6:。
1.2环境中弓形虫卵囊的浓缩技术
根据现有的水媒原生动物检测方法，环境中弓 形虫卵囊冋收浓缩步骤包括絮凝、过滤、纯化和检测 卵囊早在2002年，Kourenti等_就提出了污水 中孢子化卵囊的两种不同浓缩方法：①采用离心浓 缩法，主要是根据卵囊在不同重力下离心浓缩;②采 用絮凝沉淀浓缩，其原理是卵囊在絮凝剂（如硫酸铁 和硫酸铝）的帮助下沉淀并浓缩。其中第二种方法 是世界各大型水处理厂在地表水处理中最常用的方 法
之一。结果表明，在弓形虫卵囊的浓缩中使用适 当的絮凝剂通常比离心浓缩更为有效。而土壤、瓜 果蔬菜等固体基质中卵旗的浓缩步骤为：将土壤、果 蔬等样品研磨碎或剪碎，通过筛过滤后进行离心、震 荡、浮选等操作，即可得到大量的卵囔M:。
1.3环境中弓形虫卵囊的纯化分离技术
1.3.1蔗糖密度梯度离心法蔗糖密度梯度离心 法是根据具有不同沉降系数的颗粒离心后会在蔗糖 密度梯度的不同区域出现不同区带，整个操作十分
第3期马巧妮等：环境中弓形虫卵囊富集及检测技术的研究进展345
简便。2001年，李建华等[29；成功利用蔗糖密度梯度 离心法纯化了犊牛粪便中的隐孢子虫卵囊，在1 :2 蔗糖液和1 : 4蔗糖液间有一条纯度较高的卵囊条 带。该方法的回收率可达30%〜60%[30_33]。同时，他 们还对不同的密度梯度介质进行了比较，结果发现 阿拉伯胶粘性大，不利于卵囊与杂质的分离；胶体硅 和氯化铯的纯化分离的效果虽然很好，但因其价格 比较昂贵，所以不易推广；蔗糖是一种经济、易于获 得的离心介质，因此被广泛使用。
1.3.2 免疫磁分离法（IMS)和凝集素磁分离法（LMS)
免疫磁分离法（immunomagnetic separation，IMS)是专门用来捕获隐孢子虫卵囊的一种方法，利用此
法可以将隐孢子虫卵囊从碎片中分离出来，对检测 环境中的弓形虫卵囊也同样适用，且市场上已有商 品化的试剂盒，例如Kit DB、Kit IC1和Kit IC2[34]。Robertson等利用凝集素磁分离法（lectin-magnetic separation，LMS)成功分离出环境水样中弓形虫卵 囊，并且发现当卵囊浓度较低时，LM S法比离心法 可以富集到更多的卵囊。
2环境中弓形虫卵囊的检测技术
2.1显微检测技术
显微检测技术是一种传统的检测寄生虫卵囊的 方法。首先，要对环境样品进行分离纯化处理，用以 富集样品中的弓形虫卵囊，然后将处理后的样品进 行涂片，最后在光学显微镜下进行观察。普通显微 检测技术主要依靠人肉眼识别，该方法不仅工作量 大而且受工作人员的经验及专业程度影响较大。2.2分子生物学检测技术
2.2.1实时荧光定量P C R实时荧光定量PCR(reah time fluorescent quantitative polymerase chain reac tion，RT-FQ-PCR)是一种基于聚合酶链式反应的分 子生物学技术，可分为定量和半定量两种常见的检 测方法。不像传统的P C R只能在P C R结束时对目 标DNA分子的扩增进行监测，该技术可对整个PCR 进程进行实时监测，最后通过标准曲线就可以实现 对初始模板的定量分析^61。由于具有高灵敏度和高 通量等优点，该技术被广泛应用于病原体的定性与 定量检测[37]。2020年，Marques等[38]通
过实时定量 PC R技术对弓形虫卵囊进行了检测并估计了卵囊的 数量。结果证实了新鲜的瓜果蔬菜可以被弓形虫的 卵囊污染。2012年Maud L61u等圳以弓形虫529 bp 目的DNA序列成功建立了实时定量P C R检测方 法，用以检测在湿润和干燥环境下弓形虫的卵囊。随着科学技术的不断发展，生物芯片技术与实时定量P C R技术的联合使用拓展了该技术在寄生虫研 究领域中的应用[40]。
2.2.2 巢式PCR/半巢式PCR/单管巢式PCR巢 式PCR(nested PCR)是一种改进的聚合酶链式反应，通过减少DN A的非特异性扩增来增加DN A扩 增的特异性。通常包括两次目标序列的P C R扩增反 应，每一次扩增都有其对应的引物对。第一次扩增 反应的产物作为第二次P C R扩增的模板，与第二对 引物结合并进行下一步扩增，其产物呈指数式增长[41]。2016年，翟凯等[42]采用巢式P C R方法检测洛 阳地区不同环境土壤中弓形虫卵囊，总检出率达18.8%0
半巢式 PCR(semi-nested PCR)是以巢式 PCR 为基础建立起来的，其原理与巢式P C R基本相同，所不同的是第一次扩增产物可作为第二次扩增中所 需引物的一部分，整个过程需要三条引物和两次
P C R扩增反应％。王素华等11]以弓形虫P30基因为 目标基因，建立了半巢式P C R检测体系。与常规 P C R和巢式P C R相比，半巢式P C R的优越性在于 其操作更加简便，可降低两次加样过程中带来的潜 在污染，且敏感性更高，可检测到的DN A含量下限 为 18 fg。
单管巢式P C R是传统P C R的改良模式，因其 具有特异性强和灵敏度高的特点被广泛应用于分子 诊
断中。2014年，Wang等_利用单管半巢式PCR 技术成功建立了土壤中弓形虫卵囊的分子检测方法，同时对甘肃和青海地区土壤中弓形虫卵囊的分 布做了流行病学调查，为该地区弓形虫病的有效防 控提供了重要的理论依据。
2.2.3 环介导等温扩增技术（LAMP)LA M P技术是由日本科学家Notomi等建立的一种可以在体外对核酸进行恒温扩增的技术[4M7]。该方法只需 要一种高置换链活性的DN A聚合酶和一套特殊引 物就可以在等温条件(63〜65 °C)下对靶标基因进行 快速扩增。自从2000年Notomi等[47]研发出LAMP 技术以来，该方法取得了许多进展，包括传统LAMP、RT-LAMP、mLAMP、eLAMP、冻干 LAMP 和iD-LAMP 等。LAM P作为一种分子扩增技术得到了广泛应用，包括医疗现场监测、临床环境中基因检测、食品和环 境样本的快速检测:48#。
2.2.4 重组酶聚合酶妒增技术（recombinase polymerase amplification,RPA)RPA技术是近些年发展起 来的一种新型等温核酸扩增技术。该技术有三大核 心酶：重组酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶夂。整个反应可在恒定低温条件下进行，反应最适温度
346中国兽医科学第51卷
为37〜42 °C;5l]。Boyle等[52]采用RPA技术在20分
钟内就检测出了痰中结核菌。随着技术的不断发展，
传统的RPA技术可与电泳法、测流层析法、探针法、染法、EL1S A等方法联合使用，其中荧光定量RPA
与LF-R P A的应用最为广泛。2017年Wu等[53]以弓
形虫B1基因为目的基因，成功利用LF-R PA方法
对环境中弓形虫卵囊进行了检测。该技术具有灵敏
度高、特异性强、检测结果直观准确等优点，其灵敏
度是巢氏P C R的10倍。2014年X ia等:54：采用实时
荧光定量RPA对白斑综合征病毒(WSSV)进行了检 测。与qPCR相比，RPA技术节省了近100分钟的反
应时间，特别适合现场检测。
3展望
由于环境样品的复杂性较高，选择合适的富集
方法可以大大提高环境中弓形虫卵囊的检出率。其
中环境采样点、浓缩以及纯化分离方法的选择是决
定富集效率的关键。同样，高度特异、灵敏的检测方
法也是不可或缺的。而检测环境中弓形虫卵囊的传
统方法主要是依靠显微检测技术。由于成分复杂的
土壤中含有各种颗粒物质以及生物落等，使得弓
形虫卵•襄在显微镜下难以识别，且该方法受人为因
素影响很大。
随着分子生物学的快速发展，分子生物学检测
技术也随之应用于环境中弓形虫卵囊的分子检测。
实时荧光定量P C R是一种可以定量极微量DNA拷
贝数的分子检测方法，因此具有特异性强、灵敏度高
等优点。与传统P C R相比，套式P C R在DNA含量
极低的情况下，经过两轮扩增可以得到更多的产物，但操作较为复杂且容易出现假阳性。与套式P C R相 比，半套式P C R和单管套式P C R的特异性和敏感
度更高，且污染更少。LAM P技术可以快速、特异地
检测到弓形虫卵囊，但与实时荧光定量P C R相比，其敏感性差一些。与RPA技术相比，LAMP技术反
应时间长、价格较昂贵但假阳性少。由此可见，这些
分子检测技术或多或少都存在一些弊端，比如成本
较高、耗时耗力、操作复杂、特异性不高和敏感性差 等。因此，仍然需要进一步探索更加方便、快捷、灵 敏、特异的检测环境中弓形虫卵囊的新方法。
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