冰浴方法——KAc冰浴法
生化试验中,由于需要对样本进行保护,防止样本变质,通常需要低温处理,冰浴是常用方法之一,这里以KAc冰浴法为例,说明冰浴的操作。 (1)从标本中取合适样本,成虫腿或胸部,样本取出后置于装有无菌水的1.5ml离心管或小烧杯中,浸泡10min; (2)标本从无菌水中取出后用吸水纸吸干;
(3)将标本置于另一个1.5ml离心管中,加入100ul提取缓冲液,置于- 20 ℃冰箱中5min后取出,用研磨棒捣碎匀浆,研磨棒用400μL提取缓冲液冲洗; (4)将匀浆置于65℃水浴60min(其间取出混匀2- 3次) ;
(5)向匀浆中加入100ul(1/5倍体积)冷的8M NaAc(KAc),将离心管- 20 ℃冰浴45min以上;
(6)取出后以11000r/min离心15min,取上清液于1.5ml离心管中,加入 2倍体积预冷无水乙
醇,混匀,置于 - 20℃冰箱中低温水浴 1~2 h,沉淀 DNA;
(7)后11 000 r /min,离心15min,小心倒弃上清液,收集沉淀;
(8)在留有沉淀的管中加入100ul已预冷的70%乙醇漂洗,11000r/min离心5min,弃上清液;
(9)重复8;
(9)此时可以看到DNA沉淀在管底,然后将管口朝下放在滤纸上让DNA自然干燥;
(10)每管加入适量的 ddH2O,于 4 ℃充分溶解,-20℃保存。
所需试剂:
提取缓冲液;无菌水;8M NaAC(KAc);无水乙醇;70%乙醇;
100ml 8M NaAc(分子量 82.03):取65.62g NaAc,溶于100ml双蒸水;
100ml 8MKAc(分子量 98.14):取78.51g KAc,溶于100ml双蒸水;
提取缓冲液配制100ml
0.2M蔗糖 6.84g
0.1M Tris 1.2g
0.1M NaCl 0.58g
0.05M EDTA 1.46g
SDS 5g
dd H2O定容至100ml
用NaOH调节pH至9.2
提取缓冲液需灭菌处理