一种具有美白功效的珍珠贝活性肽及其应用

1.本发明涉及活性肽领域，更具体地，涉及一种具有美白功效的珍珠贝活性肽及其应用。

背景技术：

2.马氏珠母贝(pinctada martensii)，俗称珍珠贝，是中国南方海水珍珠养殖的主要品种，中国药典(2015)指出珍珠具有“解毒生肌，润肤祛斑”等功效。研究表明，从珍珠中提取的多肽成分具有抗氧化、抗菌、皮肤美白和促进伤口愈合等作用。珍珠主要作为珠宝工艺品资源，且珍珠蛋白含量约7％，可用于提取多肽的珍珠资源相对紧缺。孕育珍珠的贝肉富含蛋白质，据报道，每产原珠8吨，约产生1000吨珍珠贝肉副产物。目前珍珠产业中存在大量未充分利用的珍珠贝肉资源并造成环境负担，故需对珍珠贝肉进行资源化利用。
3.名称为一种缓解视疲劳、祛斑美容的组合物及其制备方法和应用的中国专利提供了一种用于缓解视疲劳、祛斑美容的组合物，该组合物含有珍珠贝或其提取物，具有祛斑美白的功效。但该专利并未进一步研究珍珠贝或其提取物及其提取物的哪些成分起到美白的作用。
4.因此，需进一步对珍珠贝肉的美白功效进行研究。

技术实现要素：

5.本发明的首要目的是克服上述现有珍珠贝肉的美白活性成分研究不足的问题，提供一种具有美白功效的珍珠贝活性肽。该具有美白功效的珍珠贝活性肽与酪氨酸酶具有较低的结合能，能与酪氨酸酶紧密结合，抑制酪氨酸酶的活性，且该具有美白功效的珍珠贝活性肽可抑制黑素的形成，从而具有良好的美白活性，在制备美白药物、抑制剂、功能性食品、化妆品等方面具有广泛的用途。
6.本发明的进一步目的是提供上述具有美白功效的珍珠贝活性肽在制备美白药物中的应用。
7.本发明的进一步目的是提供上述具有美白功效的珍珠贝活性肽在制备酪氨酸酶抑制剂中的应用。
8.本发明的进一步目的是提供上述具有美白功效的珍珠贝活性肽在制备功能性食品中的应用。
9.本发明的进一步目的是提供上述具有美白功效的珍珠贝活性肽在制备化妆品中的应用。
10.本发明的上述目的通过以下技术方案实现：
11.一种具有美白功效的珍珠贝活性肽，所述具有美白功效的珍珠贝活性肽序列为：flf。
12.本发明的发明人从珍珠贝肉中获得了特定序列的具有美白功效的珍珠贝活性肽，该具有美白功效的珍珠贝活性肽的序列为：flf(phe-leu-phe)，分子量为425.2314da。经测
定，该具有美白功效的珍珠贝活性肽与酪氨酸酶具有较低的结合能，能与酪氨酸酶紧密结合，抑制酪氨酸酶的活性，且该具有美白功效的珍珠贝活性肽可抑制黑素的形成，从而具有良好的美白活性，在制备美白药物、抑制剂、功能性食品、化妆品等方面具有广泛的用途。
13.上述具有美白功效的珍珠贝活性肽在制备美白药物中的应用也在本发明的保护范围内。
14.优选地，所述具有美白功效的珍珠贝活性肽在制备抑制黑素合成的美白药物中的应用。
15.上述具有美白功效的珍珠贝活性肽在制备酪氨酸酶抑制剂中的应用也在本发明的保护范围内。
16.研究发现，本发明的具有美白功效的珍珠贝活性肽可与酪氨酸酶通过氢键、疏水相互作用和过静电相互作用结合，从而具有良好的酪氨酸酶抑制活性，且同时具有酪氨酸酶单酚酶抑制活性和酪氨酸酶二酚酶抑制活性。
17.优选地，所述具有美白功效的珍珠贝活性肽在制备与酪氨酸酶的氨基酸残基gln307和asn310通过氢键结合的酪氨酸酶抑制剂中的应用。
18.优选地，所述具有美白功效的珍珠贝活性肽在制备与酪氨酸酶的氨基酸残基thr308、lys379和lys376通过疏水相互作用结合的酪氨酸酶抑制剂中的应用。
19.优选地，所述具有美白功效的珍珠贝活性肽在制备与酪氨酸酶的氨基酸残基glu356、asp357和asp354通过静电相互作用结合的酪氨酸酶抑制剂中的应用。
20.优选地，所述具有美白功效的珍珠贝活性肽在制备具有酪氨酸酶单酚酶抑制活性和/或酪氨酸酶二酚酶抑制活性的酪氨酸酶抑制剂中的应用。
21.上述具有美白功效的珍珠贝活性肽在制备功能性食品中的应用也在本发明的保护范围内。
22.上述具有美白功效的珍珠贝活性肽在制备化妆品中的应用也在本发明的保护范围内。
23.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
24.该具有美白功效的珍珠贝活性肽与酪氨酸酶具有较低的结合能，能与酪氨酸酶紧密结合，抑制酪氨酸酶的活性，且该具有美白功效的珍珠贝活性肽可抑制黑素的形成，从而具有良好的美白活性，在制备美白药物、抑制剂、功能性食品、化妆品等方面具有广泛的用途。
附图说明
25.图1为实施例1的体外酪氨酸酶抑制活性评价结果图。
26.图2为具有美白功效的珍珠贝活性肽与酪氨酸酶(2y9x)对接的3d和2d可视化图，其中，图2a是具有美白功效的珍珠贝活性肽与酪氨酸酶(2y9x)对接的3d可视化图，图2b是具有美白功效的珍珠贝活性肽与酪氨酸酶(2y9x)对接的2d可视化图。
27.图3为实施例2的体外酪氨酸酶抑制活性结果图。
28.图4为实施例3的具有美白功效的珍珠贝活性肽对斑马鱼存活率影响的实验结果图。
29.图5为实施例3的具有美白功效的珍珠贝活性肽对斑马鱼黑素含量的影响的实
验结果图。
30.图6为实施例3的具有美白功效的珍珠贝活性肽对斑马鱼酪氨酸酶活力的影响的实验结果图。
具体实施方式
31.为了更清楚、完整的描述本发明的技术方案，以下通过具体实施例进一步详细说明本发明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明，可以在本发明权利限定的范围内进行各种改变。
32.各实施例中使用的主要材料与试剂说明如下：
33.珍珠贝肉(马氏珠母贝肉)由北海黑珍珠海洋生物科技有限公司(中国广西)提供。
34.中性蛋白酶(10ku/g)购自南宁庞博生物工程有限公司(中国南京)。
35.l-酪氨酸、l-多巴、酪氨酸酶(br，蘑菇，500u/mg，25ku)购自上海源叶生物科技有限公司(中国南京)。
36.western及ip细胞裂解液、苯(pmsf)购自上海碧云天生物技术有限公司(中国上海)。
37.其他试剂均为分析纯，超纯水为实验室自制。
38.实施例1具有美白功效的珍珠贝活性肽的制备
39.1、酶解：将珍珠贝肉搅碎成肉糜，加超纯水(料液比1:1，w/w)并调整ph为7.25，加入中性蛋白酶(酶底比0.4％，w/w)，50℃下酶解3h，酶解结束后立即在90℃下灭酶15min，冷却室温后在4000r/min下离心15min获得珍珠贝肉酶解液，并保存于-20℃用于进一步分析。
40.2、超滤分离：采用超滤膜(3kda)按照分子量大小分离珍珠贝肉酶解液，获得分子量≥3kda和＜3kda两个组分。
41.3、体外酪氨酸酶抑制活性评价：分别将珍珠贝肉酶解液、≥3kda组分和＜3kda组分作为样液，进行体外酪氨酸酶抑制活性评价。
42.体外酪氨酸酶抑制活性实验的具体过程如下：
43.分别以l-酪氨酸和l-多巴作为单酚底物和二酚底物，取40μl l-酪氨酸溶液(0.5mm)或l-多巴溶液(0.5mm)，加入40μl样液和80μl磷酸缓冲溶液(0.05m，ph 6.8)，在37℃保温10min后加入40μl酪氨酸酶溶液(250u/ml)启动反应，在酶标仪(enspire xenon light module,200 perkin
–
elmer,beaconsfield,u.k.)波长475nm下分别测0min和30min吸光值。根据公式(1)计算酪氨酸酶抑制率(包括酪氨酸酶的单酚酶抑制率和酪氨酸酶的二酚酶抑制率)。
44.酪氨酸酶抑制率/％＝[1-(δa
1-δa2)/(δa
3-δa4)]
×
100％
ꢀꢀꢀ
(1)
[0045]
式中：a1为底物、样液、酪氨酸酶和pbs体系的吸光值；a2为样液、酪氨酸酶和pbs体系的吸光值；a3为底物、酪氨酸酶和pbs体系的吸光值；a4为酪氨酸酶和pbs体系的吸光值。
[0046]
在美白活性研究中，体外酪氨酸酶抑制活性评价可用于初步筛选的活性物。珍珠贝肉酶解液、≥3kda组分和＜3kda组分的体外酪氨酸酶抑制活性评价结果如图1所示，其中，图1a为酪氨酸酶单酚酶抑制活性结果图，图1b为酪氨酸酶二酚酶抑制活性结果图。从图1可知，珍珠贝肉酶解物、≥3kda组分和＜3kda组分都具有酪氨酸酶单酚酶抑制活性和酪氨酸酶二酚酶抑制活性；在0.5mg/ml和1mg/ml下，＜3kda组分的活性都优于酶解物和≥3kda
组分，其中在0.5mg/ml下具有显著性(p＜0.05)，这表明，活性更好的肽组分主要集中于＜3kda组分中。在1mg/ml下，＜3kda组分的二酚酶抑制活性为15.96％，略高于木瓜籽活性肽的＜1kda组分(约15％)及1-3kda组分(约5％)(木瓜籽活性肽的数据来源于文献：skin-care functions of peptides prepared from chinese quince seed protein:sequences analysis,tyrosinase inhibition and molecular docking study，yejundeng etc.industrial crops and products,volume 148,june 2020,112331)，说明＜3kda组分具有更好的酪氨酸酶抑制能力。将以＜3kda组分作为进一步研究对象，进行肽段分析。
[0047]
4、结构鉴定：采用lc-ms/ms对＜3kda组分进行结构鉴定，＜3kda组分鉴定出404个肽段，再以氨基酸残基≤10，置信度≥30为条件初步筛选，获得117个肽段。lc-ms/ms鉴定的具体过程为：经脱盐处理后的《3kda加载在液相为easy nlc 1200纳升液相系统(thermofisher,usa)中，经分析柱c18反相谱柱(2μm，75μm
×
25cm，acclaim pepmap rslc)洗脱。洗脱程序为b液(80％乙腈，0.1％甲酸)0～60min：5％～38％。采用thermofisher q exactive系统(thermofisher,usa)结合纳升喷雾nano flex离子源(thermofisher,usa)进行质谱，喷雾电压为1.9kv，离子传输管加热温度为275℃。通过一级和二级质谱先后确定肽段分子质量和氨基酸序列，ms/ms原始文件通过使用pfind搜索引擎进行分析。通过检索uniprot中pinctada martensi物种蛋白数据库，对肽序列进行匹配，确定肽段的一级结构。
[0048]
5、分子对接：将117个肽段分别与酪氨酸酶(pdb id：2y9x)进行分子对接，筛选结合能低较低的肽段。分子对接的过程为：将鉴定所得的肽段和酪氨酸酶(pdb id：2y9x)在autodock vina软件上进行分子对接，模拟肽与酪氨酸酶的可能结合方式，筛选具有最优酪氨酸酶抑制潜力的肽序列。酪氨酸酶的三维坐标从蛋白质数据库(https://www.rcsb.org/)中下载。肽的三维结构采用marvinsketch设计，并导出能量最小化的三维构象，随后将酪氨酸酶和肽分别导入autodocktools(adt)进行去水加氢等预处理。设置对接盒子中心为center_x：-7.384、center_y：-23.549和center_z：-19.8，尺寸为size_x：47.25，size_y：47.25，size_z：47.25。为了提高对接准确度，将穷举数为20，其他为默认参数。运行autodock vina对接程序，根据内置打分函数选取最优对接构象并使用discovery studio visualizer进行可视化分析。
[0049]
经分子对接后，117个肽段都与酪氨酸酶的活性位点对接，但结合能大小存在差异。结合能越低表明配体与酪氨酸酶活性中心结合越稳定。其中，具有美白功效的珍珠贝活性肽(序列为：flf，即phe-leu-phe)与酪氨酸酶(2y9x)对接结果如表1所示。该具有美白功效的珍珠贝活性肽与酪氨酸酶(2y9x)的结合能为-8.4kcal/mol，与酪氨酸酶(2y9x)具有很好的结合作用，理论上表明该具有美白功效的珍珠贝活性肽具有和酪氨酸酶活性中心紧密结合的能力。
[0050]
表1具有美白功效的珍珠贝活性肽与酪氨酸酶(2y9x)分子对接结果
[0051][0052]
该具有美白功效的珍珠贝活性肽与酪氨酸酶(2y9x)形成不同的分子间作用力，其
作用类型及数量如表2所示。
[0053]
表2具有美白功效的珍珠贝活性肽与酪氨酸酶(2y9x)分子对接位点
[0054][0055]
具有美白功效的珍珠贝活性肽可与酪氨酸酶通过氢键、疏水相互作用和过静电相互作用结合，具体如图2所示。图2为具有美白功效的珍珠贝活性肽与酪氨酸酶(2y9x)对接的3d和2d可视化结果，其中，图2a是具有美白功效的珍珠贝活性肽与酪氨酸酶(2y9x)对接的3d可视化图，图2b是具有美白功效的珍珠贝活性肽与酪氨酸酶(2y9x)对接的2d可视化图，可知，具有美白功效的珍珠贝活性肽与酪氨酸酶(2y9x)的氨基酸残基gln307和asn310形成氢键，键长分别为和键长较短说明稳定性较好；具有美白功效的珍珠贝活性肽与酪氨酸酶(2y9x)的氨基酸残基thr308、lys379和lys376形成了5个疏水相互作用；具有美白功效的珍珠贝活性肽与酪氨酸酶(2y9x)的氨基酸残基glu356、asp357和asp354形成了3个静电互相作用。多个疏水相互作用和静电相互作用的形成有助氢键结合，提高结合能，从而抑制酪氨酸酶活力。因此，选用该具有美白功效的珍珠贝活性肽(序列为：flf)作进一步的测试研究。
[0056]
6、合成：采用固相合成法，由南京杰肽生物技术公司合成，合成的具有美白功效的珍珠贝活性肽的纯度＞98％，在-20℃下保存，用于后续的测试研究。
[0057]
实施例2具有美白功效的珍珠贝活性肽的体外酪氨酸酶抑制活性评价
[0058]
以具有美白功效的珍珠贝活性肽作为样液，按前述提及的体外酪氨酸酶抑制活性实验对具有美白功效的珍珠贝活性肽进行体外酪氨酸酶抑制活性评价，结果如图3所示，在1mg/ml下，具有美白功效的珍珠贝活性肽对酪氨酸酶的单酚酶抑制率为54.32％，对酪氨酸酶的二酚酶抑制率为17.37％，表明具有美白功效的珍珠贝活性肽具有良好的酪氨酸酶单酚酶抑制活性和酪氨酸酶二酚酶抑制活性。
[0059]
具有美白功效的珍珠贝活性肽中疏水性氨基酸残基比例为100％，氨基酸残基phe和leu的疏水侧链可直接与酪氨酸酶的疏水区域相互作用，抑制酪氨酸酶活性。另外，具有美白功效的珍珠贝活性肽含有2个苯丙氨酸，苯丙氨酸与酪氨酸酶的底物酪氨酸结构相似，可能作为酪氨酸酶的假底物，增强具有美白功效的珍珠贝活性肽的酪氨酸酶抑制能力。
[0060]
实施例3基于斑马鱼模型研究具有美白功效的珍珠贝活性肽的美白功效
[0061]
1、斑马鱼的培养
[0062]
将野生型斑马鱼饲养于水温28.5℃、ph 7.5～8.5环境中，将10组斑马鱼按雌雄1:2的配种比例置于带隔板的配种缸中，雌雄分开，暗处理12h后恢复光照处理并抽出隔板使斑马鱼交配获得鱼卵，其中健康斑马鱼受精率达≥80％即可选择用于实验。
[0063]
2、具有美白功效的珍珠贝活性肽对斑马鱼存活率影响
[0064]
斑马鱼卵敏感性高，活性实验前先进行毒性验证。收集健康斑马鱼卵在96孔板中，
以每孔1尾的密度铺板，每孔加入180μl含不同浓度的具有美白功效的珍珠贝活性肽(25、50、100、150、200、250和500μg/ml)的斑马鱼培养水，每24h观察胚胎死亡情况及致畸情况，连续观察5d，观察不同浓度具有美白功效的珍珠贝活性肽对斑马鱼发育的影响，结果如图4所示。从图4可知，在25～500μg/ml浓度范围内，具有美白功效的珍珠贝活性肽处理的斑马鱼均全部存活，生理状态正常。将在此基础上进行具有美白功效的珍珠贝活性肽的美白功效研究。
[0065]
3、具有美白功效的珍珠贝活性肽对斑马鱼黑素含量和酪氨酸酶活力的影响
[0066]
产的斑马鱼卵通体透明，随着受精卵的发育，斑马鱼卵体表和体内的黑素逐步生成，最终鱼卵发育成鱼，可直接观察到斑马鱼体表黑生成情况，反映样品对斑马鱼中黑素合成的影响，进而评估美白效果。谷胱甘肽(gsh)是具有抗氧化效果和美白效果的短段，常被应用于功能性食品或化妆品中，可作为美白活性肽的阳性对照。
[0067]
收集受精24h后的健康斑马鱼卵，在12孔板中以每孔20尾的密度铺板，分别加入2ml含具有美白功效的珍珠贝活性肽的斑马鱼培养水(10μg/ml、50μg/ml和200μg/ml)，分别设置空白组(2ml培养水)、阳性对照组(含gsh的培养水，10μg/ml、50μg/ml、200μg/ml)。在28.5℃下恒温处理48h后，取斑马鱼于体视镜(nikon smz460，nikon corporation，japan)下观察形态及黑素分布情况并拍摄背视图和侧视图，结果如图5a所示。收集其余斑马鱼用蒸馏水洗涤后冰冻(-80℃)处死，加入冰浴后的200μl western及ip细胞裂解液(含1％(体积分数)1mm pmsf)并反复冻融3次破碎鱼体，4000r/min离心10min，得上清液和沉淀。
[0068]
取沉淀用于测定黑素含量，沉淀加入250μl naoh溶液(1m，10％dmso)，85℃水浴2h，取100μl加入96孔板中，在405nm下测定吸光值。每个样品均以bca试剂盒(碧云天)进行归一化处理。根据公式(2)分别计算相对黑素含量。
[0069]
相对黑素含量/％＝(a
t
/ao)
×
100％
ꢀꢀꢀ
(2)
[0070]
式中：a
t
为具有美白功效的珍珠贝活性肽处理组或阳性对照(gsh)组的吸光值；a0为空白组的吸光值。
[0071]
取上清液用于测定酪氨酸酶活力，在96孔板中将20μl上清液和180μl l-多巴(1mg/ml)混匀后避光37℃孵育2h，475nm下测定吸光值，根据公式(3)分别计算相对酪氨酸酶活力。
[0072]
相对酪氨酸酶活力/％＝(a
t’/a
o’)
×
100％
ꢀꢀꢀ
(3)
[0073]
式中：a
t’为具有美白功效的珍珠贝活性肽处理组或阳性对照(gsh)组的吸光值；a0’
为空白组的吸光值。
[0074]
从图5a可知，与空白组对比，在200μg/ml下，具有美白功效的珍珠贝活性肽处理的斑马鱼在背视图中头部黑“v”字型斑点区域明显减少，在侧视图中腹部的黑斑点减淡，鱼体比空白组透明的现象。
[0075]
相对黑素含量的测试结果如图5b所示，从图5b可知，具有美白功效的珍珠贝活性肽处理的马鱼黑素含量都比空白组显著降低(p＜0.05)。在浓度为10、50和200μg/ml的具有美白功效的珍珠贝活性肽处理下，斑马鱼中黑素含量相比空白组分别降低了31.10％、35.07％和37.34％。这表明了具有美白功效的珍珠贝活性肽表现出良好的黑素抑制能力。当浓度为10、50和200μg/ml时，具有美白功效的珍珠贝活性肽处理组比相同浓度的阳性对照组(gsh)分别降低16.52％、12.51％和13.41％黑素含量，表明具有美白功效
的珍珠贝活性肽表现出比阳性对照(gsh)更强的黑素抑制作用。
[0076]
相对酪氨酸酶活力的测试结果如图6所示，与空白组相比，具有美白功效的珍珠贝活性肽可显著降低斑马鱼体内的酪氨酸酶活力(p＜0.05)。在浓度为10、50和200μg/ml的具有美白功效的珍珠贝活性肽处理下，斑马鱼酪氨酸酶活力分别比空白组降低了46.43％、68.04％和75.41％，同时分别比相同浓度的阳性对照组(gsh)降低15.75％、33.01％和38.97％。这表明，具有美白功效的珍珠贝活性肽表现出良好的酪氨酸酶抑制能力，且具有美白功效的珍珠贝活性肽的酪氨酸酶抑制能力显著优于gsh(p＜0.05)。以上结果表明，具有美白功效的珍珠贝活性肽在斑马鱼模型上具有良好的酪氨酸酶抑制活力，可通过抑制酶活力降低黑素生成量，达到美白效果。
[0077]
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

技术特征：

1.一种具有美白功效的珍珠贝活性肽，其特征在于，所述具有美白功效的珍珠贝活性肽的序列为：flf。2.权利要求1所述具有美白功效的珍珠贝活性肽在制备美白药物中的应用。3.权利要求1所述具有美白功效的珍珠贝活性肽在制备抑制黑素合成的美白药物中的应用。4.权利要求1所述具有美白功效的珍珠贝活性肽在制备酪氨酸酶抑制剂中的应用。5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述具有美白功效的珍珠贝活性肽在制备与酪氨酸酶的氨基酸残基gln307和asn310通过氢键结合的酪氨酸酶抑制剂中的应用。6.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述具有美白功效的珍珠贝活性肽在制备与酪氨酸酶的氨基酸残基thr308、lys379和lys376通过疏水相互作用结合的酪氨酸酶抑制剂中的应用。7.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述具有美白功效的珍珠贝活性肽在制备与酪氨酸酶的氨基酸残基glu356、asp357和asp354通过静电相互作用结合的酪氨酸酶抑制剂中的应用。8.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述具有美白功效的珍珠贝活性肽在制备具有酪氨酸酶单酚酶抑制活性和/或酪氨酸酶二酚酶抑制活性的酪氨酸酶抑制剂中的应用。9.权利要求1所述具有美白功效的珍珠贝活性肽在制备功能性食品中的应用。10.权利要求1所述具有美白功效的珍珠贝活性肽在制备化妆品中的应用。

技术总结

本发明涉及一种具有美白功效的珍珠贝活性肽及其应用。该具有美白功效的珍珠贝活性肽的序列为：FLF(Phe-Leu-Phe)。经测定，该具有美白功效的珍珠贝活性肽与酪氨酸酶具有较低的结合能，能与酪氨酸酶紧密结合，抑制酪氨酸酶的活性，且该具有美白功效的珍珠贝活性肽可抑制黑素的形成，从而具有良好的美白活性，在制备美白药物、抑制剂、功能性食品、化妆品等方面具有广泛的用途。面具有广泛的用途。面具有广泛的用途。