定义：紫外可见分光光度法：根据被测量物质分子对紫外-可见波段范围 （150～800纳米）单辐射的吸收或反射强度来进行物质的定性、定量或结构分析的一种方法； 分子荧光光度法：利用物质吸收较短波长的光能后发射较长波长特征光谱的性质，对物质定性或定量分析的方法。可以从发射光谱或激发光谱进行分析。 组成部件：紫外可见分光光度法：①辐射源。必须具有稳定的、有足够输出功率的、能提供仪器使用波段的连续光谱，如钨灯、卤钨灯（波长范围350～2500纳米） ，氘灯或氢灯（180～460纳米），或可调谐染料激光光源等。②单器。它由入射、出射狭缝、透镜系统和散元件（棱镜或光栅）组成，是用以产生高纯度单光束的装置，其功能包括将光源产生的复合光分解为单光和分出所需的单光束。③试样容器，又称吸收池。供盛放试液进行吸光度测量之用，分为石英池和玻璃池两种，前者适用于紫外到可见区，后者只适用于可见区。容器的光程一般为 0.5～10厘米。④检测器 ， 又称光电转换器 。 常用的有光电管或光电倍增管。。⑤显示装置。这部分装置发展较快。较高级的光度计 ，常备有微处理机 、荧光屏显示和记录仪等 ，可将图谱、数据和操作条件都显示出来。
分子荧光光度法：激发光源、单器、样品池、检测器和记录显示部分。1. 光源 能发射紫外到可见区波长的光、强度大、稳定。常用的有溴钨灯、高压汞灯、氙灯。2. 单器，两个单器。3. 样品池 通常用石英制成。4. 检测器：光电倍增管。
常见类型：紫外可见分光光度法：1.单光束。简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。 2.双光束 自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价格较高。3.双波长。将不同波长的两束单光(λ1、λ2) 快束交替通过同一吸收池而后到达检测器。产生交流信号。无需参比池。△=1～2nm。两波长同时扫描即可获得导数光谱。
分子荧光光度法：1. 光电荧光计 用滤光片作单器（激发滤光片和荧光光片），溴钨灯或高压汞灯作光源，光电管为检测器。2. 荧光分光光度计 用氙灯作光源、光栅作单器，光电倍增管为检测器。可连续扫描激发光谱和荧光光谱。
原理： 紫外可见分光光度法：紫外 - 可见吸收光谱通常由一个或几个宽吸收谱带组成。最大吸收波长（λmax）表示物质对辐射的特征吸收或选择吸收，它与分子中外层电子或价电子的结构（ 或成键、非键和反键电子 ）有关。朗伯-比尔定律是分光光度法和比法的基础。这个定律表示：当一束具有I0强度的单辐射照射到吸收层厚度为b，浓度为c的吸光物质时，辐射能的吸收依赖于该物质的浓度与吸收层的厚度。其数学表达式为： 式中的
A叫做吸光度；I0为入射辐射强度；I为透过吸收层的辐射强度；（I／I0）称紫藤为透射率T；ε是一个常数，叫做摩尔吸光系数，ε值愈大，分光光度法测定的灵敏度愈高。
分子荧光光度法：分子吸收能量后，从基态最低振动能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态的不同振动能级（这一过程速度很快，大约10-15 s），成为激发单重态分子。激发态分子不稳定，可以通过以下几种途径释放能量返回基态。1. 振动驰豫 。这一过程只能发生在同一电子能级内，即分子通过碰撞以热的形式损失部分能量，从较高振动能级下降到该电子能级的最低振动能级上。由于这一部分能量以热的形式释放，而不是以光辐射形式发出，故振动驰豫属于无辐射跃迁。 2. 内转换 。即激发态分子将多余的能量转变为热能，从较高电子能级降至较低的电子能级。内转换也属于无辐射跃迁。3. 荧光
较高激发态分子经无辐射跃迁降至第一电子激发单重态的最低振动能级后，仍不稳定，停留较短时间后（约10-8 s，称作荧光寿命），以光辐射形式放出能量，回到基态各振动能级，这时所发射的光称为荧光。当然也可以无辐射跃迁形式返回基态。 4. 系间窜跃 有些物质的激发态分子通过振动驰豫和内转换下降到第一电子激发态的最低振动能级后，有可能经过另一个无辐射跃迁转移至激发三重态，这一过程伴随着自旋方向的改变，称为
系间窜跃。对于大多数物质，系间窜跃是禁阻的。如果分子中有重原子（如I、Br等）存在，由于自旋-轨道的强偶合作用，电子自旋方向可以改变，系间窜跃就变得容易了。荧光的检测： 光源发出的紫外可见光通过激发单器分出不同波长的激发光，照射到样品溶液上，激发样品产生荧光。样品发出的荧光为宽带光谱，需通过发射单器分光后再进入检测器，检测不同发射波长下的荧光强度F。由于激发光不可能完全被吸收，可透过溶液，为了防止透射光对荧光测定的干扰，常在与激发光垂直的方向检测荧光（因荧光是向各个方向发射的）。 激发与荧光光谱的形成： 任何荧光物质，都具有两种特征光谱，即激发光谱(excitation spectrum)和荧光发射光谱(fluorescence emission spectrum)。
荧光光谱，又称发射光谱。保持激发光波长不变（即固定激发单器），依次改变荧光发射波长，测定样品在不同波长处发射的荧光强度F。以发射波长为横坐标，以荧光强度F为纵坐标作图，得到荧光发射光谱。荧光发射光谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最大发射波长。
灵敏度：紫外可见分光光度法：灵敏度很高，达0.00001-0.0000001mol/L；
分子荧光光度法：由于分子荧光是从入射光的直角方向入射，因而灵 敏度要
比紫外可见高2-4个数量级，它的测定下限在 0.1-0.001ug/mL。
选择性：紫外可见分光光度法：一个物质若含有生基团，它就会产生紫外和可见吸收，反过来根据紫外-可见吸收光谱便可判断某些官能团的存在，即进行官能团的鉴别，紫外-可见吸收光谱的获得是建立在测定出物质对不同波长光（单光）吸收的基础上的。选择性较高。
分子荧光光度法：一个物质只要能产生荧光，则可以根据荧光光谱判别物质的种类（前提是量子产率达到要求），因而选择性较高 ，但由于不是所有物质都有荧光光谱，应用有一定限制。
影响因素：紫外可见分光光度法：1.共轭效应，共轭效应越强，能量差越小，最大吸收波长想长波方向，吸收强度也增大。2.立体化学校应，包括空间位阻和跨环效应，均有影响。3.溶剂的影响，在溶液中物质是溶剂化的，影响了溶质分子的自由转动，引起光谱结构精细结构的消失。4.体系PH的影响，无论是酸性碱性，体系的PH对紫外可见光谱的影 响是普遍的现象。
分子荧光光度法：1.跃迁类型，物质必须在紫外可见区有强吸收和高荧光效率才能产生荧光。具有—* 跃迁的分子才有强吸收。—* 跃迁的大。2. 共轭效应：大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或杂环，具有共轭的～* 跃迁。其共轭程度愈大，荧光效率也愈大，且最大激发和发射波长都向长波长方向移动，如苯、萘、蒽三种物质。3.刚性平面结构：当荧光分子共轭程度相同时，分子的刚性和共平面性越大，荧光效率越大。有些物质本身不发荧光或荧光较弱，但和金属离子形成配合物后，如果刚性和共平面性增加，就可以发荧光或增强荧光。如8-羟基喹啉是弱荧光物质，与Mg2+、Al3+ 等金属离子形成的配合物的荧光增强，利用这一特点可以间接测定金属离子。4. 取代基团 。荧光分子上的各种取代基对分子的荧光光谱和荧光强度都有很大影响。给电子取代基如—NH2、—OH、—OCH3、—CN、—NHR、—NR2等，能增加分子的π电子共轭程度，使荧光效率提高。而-COOH、—NO2、—C=O、—F、—Cl等吸电子取代基，可减弱分子π电子共轭性，使荧光减弱甚至熄灭。还有一类取代基则对荧光的影响不明显，如—R。5.温度。温度对被测溶液的荧光强度有明显的影响。当温度升高时，介质粘度减小，分子运动加快，分子间碰撞几率增加，从而使分子无辐射跃迁增加，荧光效率降低。故降低温度有利于提高荧光效率及荧光强度。6. 溶剂：同一种荧光物质在不同的溶剂中，其荧光光谱的位置和荧光强度可能会有一
定的差别，尤其是那些分子中含有极性取代基的荧光物质，它们的荧光光谱易受溶剂的影响。6.溶液的酸度（pH值）对荧光物质的影响可以分两个方面： 1．若荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液pH值改变，物质分子和其离子间的平衡也随之发生变化，而不同形体具有其各自特定的荧光光谱和荧光效率。例如苯胺。2. 对于金属离子与有机试剂生成的荧光配合物，溶液pH值的改变会影响配合物的组成，从而影响它们的荧光性质。例如Ga3+离子与邻-二羟基偶氮苯，在pH3～4的溶液中形成1:1配合物，能产生荧光。而在卤钨灯光谱pH6～7的溶液中，则形成12的配合物，不产生荧光。
误差来源：紫外可见分光光度法：偏离比尔定律、仪器本身的测量误差。偏离比尔定律的原因：1，比尔定律本身的局限，仅在单光下成立。2，非单入射光引起的偏离。比尔定律仅在入射光为单光时才成立
事实上单器很难将光源的连续光散成其正的单光，而是具有较窄波长范围的复合光，光通量为0.01～5nm 。还有溶液的化学偏离。由于被测物质在溶液中发生缔合、离解、互变异构，生成逐级配合物等化学原因造成对比尔定律的偏离。
分子荧光光度法：荧光熄灭：由于荧光物质分子间或与其它物质相互作用，引起荧光强度
显著下降的现象叫做荧光熄灭（quenching）或猝灭。引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂，如卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物和羧基化合物等。
注意事项：紫外可见分光光度法：显温度，显时间，溶剂的影响，合适的PH。
分子荧光光度法：激发波长的选择，激发时间的选择，常闭物质的选择等。
分析方法：紫外可见分光光度法：定性分析：根据吸收光谱的形状，吸收峰的数目， 用经验规则计算λmax,与测定的λmax比较 ； 比较未知物与标准物质在相同化学环境与测量条件下的紫外-可见吸收光谱，若吸收光谱的形状、吸收峰的数目、 εmax(λ)、λmax完全相同，就可以确定未知物与标准物质具有相同的生团与助团，但并不能断定两者为同一化合物。结构分析：根据官能团特征波普来判断。定量分析：比尔定律，可利用工作曲线求解，多组分同时测定时，可用吸光度加和性求解。
分子荧光光度法：定性分析：荧光物质的特征光谱包括激发光谱和荧光光谱，因此用它鉴定物质比吸收光谱可靠。定量分析：标准曲线法和直接比较法。
应用： 紫外可见分光光度法：无机阴、阳离子的测定
利用高灵敏、高选择性的有机显剂，与被测无机离子发生配合或氧化还原反应，可测定周期表中绝大多数元素。两组分的同时测定
例：临床中麻醉剂：普鲁卡因丁卡因注射液
它含有两种成分：盐酸普鲁卡因和盐酸丁卡因
这两种化合物结构相似，最大吸收波长分别为291和312nm。但盐酸丁卡因的毒性比前者大10倍，因此配制时应严格限制其含量，可采用双波长，利用吸光度具有加和性来测定和求解，以减少二种化合物吸收峰重叠而产生的测量误差。有机化合物的定量分析
直接法。若有机化合物本身在结构上含有双键或芳环，即含有共轭电子，则可直接测定其含量。如微量氨基酸的测定。氨基酸的吸收波长在280nm左右，且ε 较小,低含量的氨基酸很难用直接法准确测定。可用茚三酮与各种氨基酸反应，生成无还原型茚三酮，过量的茚三酮又与还原型茚三酮和氨缩合生成紫蓝产物，称为Ruhemann紫，lmax=570nm，利用此反应可测微量的氨基酸。
分子荧光光度法：有机物的荧光分析：由于荧光分析的高灵敏度、高选择性，使它
在医学检验、卫生检验、药物分析、环境检测及食品分析等方面有广泛的应用。
芳香族及具有芳香结构的物质，在紫外光照射下能产生荧光。因此，荧光分析法可直接用于这类有机物的测定，如：多环胺类、萘酚类、嘌呤类、吲哚类、多环芳烃类、具有芳环或芳杂环结构的氨基酸及蛋白质等，约有200多种。食品中维生素含量的测定是食品分析的常规项目，几乎所有种类的维生素都可以用荧光法进行分析。多环芳烃普遍存在于大气、水、土壤、动植物及加工食品中，大家所熟知的苯并[a]芘是致癌活性最强的一种，通过萃取或谱分离后，可采用荧光法进行测定。该方法准确可靠，测定最低浓度可达 0.1 g/ml。应用实例：食品中VB2（核黄素）的测定 其测定原理是VB2在440～500 nm波长的光照射下，发出黄绿荧光，在波长525 nm下测定其荧光强度，在稀溶液中其荧光强度与VB2的浓度成正比。为消除试液中共存荧光杂质的干扰，可在测定过荧光强度的溶液中加入连二亚硫酸钠（Na2S2O4），将VB2还原为无荧光的物质，然后再测定试液中残余的荧光杂质的荧光强度，两者之差即为食品中VB2的荧光强度。该方法被作为食品分析的国家标准分析方法。
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