虽然各种类型的显微镜能够观察到微生物的各种形态结构，但一般实验室常用的是普通光学显微镜。由于细菌体积小且透明，在活体细胞内又含有大量的水分，因此，对光线的吸收和反射与水溶液相差不大。当把细菌悬浮在水滴内，放在显微镜下观察时，由于与周围背景没有显著的明暗差，难于看清它们的形状，更谈不上识别其细微结构。而经过染，就可借助颜的反衬作用比较清楚地看到菌体形态，亦即菌体表面及内部结构着与背景形成鲜明对比，这样便可在普通光学显微镜下清晰地观察到微生物的形状和结构，而且还可以通过不同的染反应来鉴别微生物的类型和区分死、活细菌等，因此，微生物染技术是观察微生物形态结构的重要手段。 本实验通过对细菌的染观察，使同学们在掌握细菌染技术的基础上，了解各种其他的染制片技术；观察微生物的各种形态结构，以巩固课堂知识，增强感性认识。
一、目的要求
1．学习微生物涂片、染的基本技术，掌握细菌的单染方法及无菌操作技术。
2．巩固显微镜的使用方法。
二、基本原理
1.简单染法：所谓单染法是利用单一染料对细菌进行染的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。 在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以常用碱性染料进行染。碱性染料并不是碱，和其他染料一样是一种盐，电离时染料离子带正电，易与带负电荷的细菌结合而使细菌着。例如，美蓝（亚甲蓝）实际上是氯化亚甲蓝盐，它可被电离成正、负离子：
带正电荷的染料离子可使细菌细胞染成蓝。常用的碱性染料除美蓝外，还有结晶紫（crystal violet）、碱性复红（basicfu-chsin）、番红（又称沙黄，safranine）等。
细菌体积小，较透明，如未经染常不易识别，而经着后，与背景形成鲜明的对比，使易于在显微镜下进行观察。
2.革兰氏染法：是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染法。该染法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。
G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇脱时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱，再经复红复染后就成红。
G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜。
革兰氏染需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染的初染液一般是结晶紫（crystal violet）。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。脱剂是将被染的细胞进行
脱，不同类型的细胞脱反应不同，有的能被脱，有的则不能，脱剂常用95％的酒精（ethanol）。复染液也是一种碱性染料，其颜不同于初染液，复染的目的是使被脱的细胞染上不同于初染液的颜，而未被脱的细胞仍然保持初染的颜，从而将细胞区分成G+加香和G-两大类，常用的复染液是复红。
三、器材
1、活材料：培养24小时的大肠杆菌和葡萄球菌。
2、染液和试剂：碱性美兰、结晶紫、碘液、95%酒精、石炭酸复红 、蒸馏水、乙醚-乙醇混合液、香柏油。
3、器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜。
四、操作步骤
1、简单染：
（1）涂片：取干净载玻片一块，在载玻片中央加一滴蒸馏水，按无菌操作法取大肠杆菌涂
片，调匀并涂成薄膜，注意滴生理盐水时不宜过多，涂片必须均匀，做成浓菌液，注意取菌不要太多。
（2）晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。
（3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜），使细胞质凝固，以固定细菌的形态，并使其不易脱落。但不能在火焰上烤，否则细菌形态将毁坏
（4）染：将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复红染1-2min
（5）水洗：用水洗去涂片上的染液，直至冲下之水无时为止。
（6）干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。
（7）镜检：先低倍观察，再高倍观察，并出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。
2、革兰氏染：
（1）涂片
（2）晾干
（3）固定，与简单染法相同
（4）结晶紫染：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染液染1分钟；水洗：倾去染液，用水小心地冲洗。
（5）媒染：碘液，媒染1min；水洗：用水洗去碘液。
（6）脱：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱20—25s至流出液无，立即水洗。
（7）复染：滴加复红复染3-5min；水洗：用水洗去涂片上的复红染液。
（8）晾干：将染好的涂片用吸水纸吸干。
（9）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染反应性。
（10)实验完毕后的处理：
①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，
a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。
b.用擦镜纸沾少许乙醚-乙醇混合液将镜头擦2-3次。
c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2-3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。将显微镜小心轻拿，按号放入显微镜柜中。
②观察后的染玻片用废纸将香柏油擦干净，放入回收容器内。
五.注意事项
1.革兰氏染成败的关键是酒精脱。如脱过度，革兰氏阳性菌也可被脱而染成阴性菌；如脱时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。
2.染过程中勿使染液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染液被稀释而影响染效果。
3.选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16h，E.coli培养24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。
五、实验报告
1．结果
绘出葡萄球菌和大肠杆菌的形态图，并注明两菌的革兰氏染的反应性。
2．思考题
（1）作革兰氏染涂片为什么不能过于浓厚？
（2）其染成败的关键一步是什么？
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